影響凝膠色譜的分離的因素及其改進方法

1、影響凝膠色譜的分離的因素及其改進方法吳承志張宇封樹林孫振鵬( 西南大學藥學院，重慶， 400716)摘要：凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而乂簡單的分離分析技術(shù)，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法乂稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量 分級分析以及 相對分子質(zhì)量分布測試。目前已經(jīng)被生物化學、分子生物學、生物工 程學、分子免疫學 以及醫(yī)學等有關領域廣泛采用，不但應用于科學實驗研究，而 且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè) 生產(chǎn)。關鍵詞：凝膠色譜；影響因素；填料；改進方法Influence factors of the separatio

2、n gel chromatography and improving methodsWu chengzhi Zhang ning Fengshuling Sun zhenpeng(College of Pharmaceutical Sciences, SouthwestUniversity, Chongqing 400716)Abstract ： Gel chromatography was developed in the early sixties a quick and simple separation techniques, because the equipment is simp

3、le, easy to operate, does not require organic solvents, the polymer material has a high separation efficiency ? Also known as gel permeation chromatography molecular exclusion chromatography. GPC is mainly used for classification of polymer molecular weight and molecular weight distribution of the t

4、est? Hasnow been biochemistry, molecular biology, biological engineering, medicine, molecular immunology and related fields widely used, not only used inscientific experimental research, and has a large scale for industrial production.Keywords: gel chromatography; Influencing factors: Packing; Impro

5、vement methods凝膠色譜法乂叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而乂簡單 的分 離分析技術(shù)，山于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很 高的分離 效果。凝膠色譜法乂稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相 對分子質(zhì)量分 級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫 溶劑主要是水。用 于有機溶劑中可溶的高聚物（聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚 中基丙烯酸屮酯等）相 對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝 膠，洗脫溶劑為四氫咲喃等 有機溶劑。 凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相 對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布， 同時根據(jù)所用凝

6、膠填料不同，可分離油溶性和水 溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從 兒白萬到 100 以下。近年來，凝膠色譜也廣 泛用于分離小分子化合物?；瘜W結(jié)構(gòu)不同但 相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過 凝膠色譜法達到完全的分離純化的 U 的。凝膠色 譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量 分級分析以及相對勿子質(zhì)量分布測試。目前已經(jīng)被生 物化學、分子生物學、生物工 程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關領域廣泛采用，不但應 用于科學實驗研究，而且 已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。1 凝膠色譜的分離效果的因素主要影響的因素有色譜柱填料的孔徑大小及其粒徑分布均勻性， 其次是流動 相、色 譜柱高度、色譜柱的直徑以及個人操作等。1.1 首

7、先，填料的孔徑大小一定要合適， 孔徑太小， 待測物不易流出， 分析 時間長， 展寬嚴重；孔徑太大則很可能導致組分分不開。在做凝膠色譜時，需要先 大致估計下待 分析物的分子量，然后選擇合適的柱子，如果不知道粒徑，可先用大 孔徑的先試試，接 著再用小粒徑的以達到更高的精度。市售的柱子上都有該柱適用 的分子量范圍，一般選 待測物分子量在色譜柱的最大分子量的 20%-80%為宜。凝膠的顆粒粗細與分離效果有直接關系。一般來說，細顆粒分離效果好，但 流速 慢；而粗顆粒流速快，但會使區(qū)帶擴散，使洗脫峰變平而寬。因此，如用細顆 粒凝膠宜 用大直徑的層析柱，用粗顆粒時用小直徑的層析柱。在實際操作中，要根 據(jù)工作

8、需要， 選擇適當?shù)念w粒大小并調(diào)整流速。1.2 其次是流動相。凝膠色譜中流動相的影響不像別的色譜（如反相 or 離子 色 譜）那么明顯。其中主要影響的是流動相的流速，一般流速越大，出峰越快，但 分離效 果可能不是很好。1.3 其次是色譜柱的高度和直徑。一般來說，色譜柱越長，樣品組分分的越 開， 但過長時會消耗太多的溶劑，而且柱展寬等也容易變的嚴重。色譜柱直徑太大 時，樣品 沿徑向的分布容易不均勻，容易出現(xiàn)柱中心處比柱四周跑的快，從而增加 了展寬。1.4 個人操作。這點在全手動操作的柱色譜中影響較大，對半自動的則影響較小。主要要注意加樣時一定注意保證樣品各組分在同一個“起跑線”上“起跑” .而凝膠

9、色譜中的凝膠采用合成葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等有機凝膠，這些有機凝膠的膠質(zhì)軟，機械強度低，填料的粒度一般用 37-75 Po 色譜柱長 12 尺以上，柱徑 7. 8 毫米，流速通常用 1 毫升/分。在這些條件下，一次 實驗時間往往需 要三小時。加快流速會降低分離效率，因為凝膠色譜是一個山擴散 控制的分離過程，高 分子在溶液中擴散較慢，這就必然使流速受到一定限制。最終 導致凝膠色譜的處理量 小，時間長，分離效果不佳；分子尺寸相同的混合物（如異 構(gòu)體的混合物）不易分開2 改進方法最近凝膠色譜的大量研究匚作仍是多方面的，其中儀器、填料、檢測方法的研究、以及色譜理論等方面的進展是和整個液

10、體色譜的進展相關的。2. 1填料填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于 3um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效 可提高 分離度，但不是唯一的因素。凝膠色譜填料合成技術(shù)的進展主要在下面四個方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學改性的發(fā)展。這些新發(fā)展的無機凝膠填料機械強度高，粒徑小，可達到較高的柱效，孔容大，分離范圍廣，使用壽命長等優(yōu)點，下面是一些填料的介紹：硅膠基質(zhì)填料以硅膠為基質(zhì)的高效親水凝膠色譜填料，多以甘油瞇基（即二醇基）進行硅膠的表面修飾，氨基、咪醴基、尿素及取代尿

11、素等也可作為其親水基團。為提高其表面的親水性和生物相容性，將葡聚糖接枝在硅膠表面，以分離蛋白質(zhì)；但使用最廣泛的仍然是二醇基，這與二醇基填料合成簡單且生物相容性好等特點不無關系。以硅膠為基質(zhì)的色譜填料因表面游離的硅羥基具有弱陽離子交換作用，對極性化合物和離子型化合物都有一定的非特異性吸附，所以不能直接用作多肽和蛋口質(zhì)分離分析用的凝膠過濾色譜填料，需要鍵合親水官能團才能成為親水性凝膠過濾色譜填料。在親水凝膠色譜中，多選用硅烷化試劑作為配基進行修飾， 以產(chǎn)生親水性的二 醇基，其反應如下：O0、S YX 4 (CH.O)CK；1 .-O-CBj- CH-CH, ? -S-O-SKCa.Oj-CCB,O

12、-CBj-Ca-CStV / H-CHj ? H ； 0 -SI O-SI(CH k0-CH,),-O-CMj-CH-CM,OH 6H且該填料也在相關實驗中證實：其分離度要比一些有機凝膠要好，而且該填料也表現(xiàn)出很好的機械強度，穩(wěn)定性和保持著很好的抗壓能力，相比時間上也縮短了不少。2. 2 檢測方法的研究檢測方法也是色譜學研究的熱點之一，人們不斷更新 檢測器的靈敏度，使色譜分析能夠更靈敏地進行分 析。人們還將其他光譜的技術(shù)引入色譜，如進行色譜 質(zhì)譜連用、色譜一紅外光譜連用、色譜一紫外連用 等，在分離化合物的同時即行測定化合物的結(jié)構(gòu)。色 譜檢測器的發(fā)展還伴隨著數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，檢測 獲得的數(shù)據(jù)隨

13、即進行計算處理，使試驗者獲得更多信 息。如今又很多應用了，例如凝膠色譜凈化濃縮聯(lián)用 儀在毒物分析中的應用；利用凝膠滲透色譜 - 激光光散 射聯(lián)用技術(shù) (GPC-MALLS) 測定醫(yī)用高分子材料的分子量 及分子量的分布；凝膠色譜與紫外吸收分析儀聯(lián)用技 術(shù)分離青霉素 G 中抗原性高分子雜質(zhì)等等，相信凝膠 色譜聯(lián)用技術(shù)會越來越廣泛的得到應用。2. 3 儀器通過與其他儀器聯(lián)用，解決凝膠色譜法測定高聚物分子量分布從相對法向絕 對法 過渡。測定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的應用。試樣先根據(jù)分子體積( 即分子量) 分離后再檢測各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色 譜柱中進行 的，被分離后的

14、組分在流出柱子時就同時連續(xù)地用濃度檢測器和分子量 檢測器分別檢側(cè) 各組分的濃度和分子量，把兩個檢測器的輸出訊號用記錄儀記錄后 即得反映分子量分布 的凝膠色譜曲線。過去山于沒有比較靈敬和瞬時響應的分子量 檢測器，因而利用一組不 同分子量的標樣來標定色譜柱，然后從分子量淋出休積的 標定曲線來作數(shù)據(jù)換算。這種 用相對方法來檢測分子量雖然暫時解決了問題，但是 隨之而來的是實驗丄作量增加以及 數(shù)據(jù)處理方法上存在困難。實驗數(shù)據(jù)的可靠性在 很大程度上決定于標定曲線、標樣分子 量數(shù)值以及數(shù)據(jù)處理方法的可靠性。其中色 譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應的改正，不但實驗方法比較煩瑣，而 且數(shù)據(jù)處理也比較復雜

15、，需要用電子計算機來計 算。所以雖然文獻中已經(jīng)推薦許多 據(jù)說是比較滿意的計算方法，但這總不是一個根本解 決的方法。只有真正找到絕對 分子量檢測器，問題才算較好解決。原有的許多分子量測 定方法，山于不能做到足 夠靈敬的瞬時響應而未能成功地在凝膠色譜上應用。最近Ouano用激光小角光散射儀（LALLS）來作分子量檢測器得到比較好的結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)不需要標定曲線，也不必進行峰加寬改正。山于激光的準直性較好，強度較大，可以允許在較小的角度下測量較稀溶液的散射光強，山此可以直接訃算出重均分子量的近似值而不需要象經(jīng)典光散射那樣實驗數(shù)據(jù)還要對濃度和散射角度向零作雙外推。 實驗上，凝膠色譜儀和激光小角光 散射儀

16、聯(lián)用后， 還可與計算機直接聯(lián)接進行數(shù)據(jù)處理。在一次實驗進行完畢后，所 需要的數(shù)據(jù)可全部立 即取得。GPC-LALLS以乎得到更合理的數(shù)值。激光小角散射儀 已開始商品化，預計不久 將會有更多的研究工作，來說明已經(jīng)在何種程度上解決了 凝膠色譜的相對測定過渡到絕 對測定。凝膠色譜中的濃度檢測器和通常的液體色譜 一樣仍然是一個薄弱環(huán)節(jié)，繼續(xù)在 尋找更理想的檢測器。 LI 前最常用的仍然是示差 折光檢測器和紫外檢測器。最近 Hoffmann 和 Urban 用自動濁度滴定裝置來作濃度檢測器也收到一定效 果， 特別對二元共聚中測定分子量分布和組成分布，效果比較顯著。 Jorgenson 等 用光散射 法側(cè)定淋出溶質(zhì)的沉淀，也證明是一個較靈敬的方法。 Francois 等用密 度計來檢側(cè)濃 度，提供了另一條通用性檢測器的途徑。其他如質(zhì)譜和原子吸收光譜 也都能與凝膠色 譜聯(lián)用。隨著應用的擴大，凝膠色譜可以用于測定高聚物長支鏈的 支化度。2.4 在色譜理論上的改進2. 4. 1 塔板理論保留時間是樣品從進入色