PD-1在冠心病患者外周血T細(xì)胞表達(dá)的意義及辛伐他汀的調(diào)節(jié)作用

1、PD-1 在冠心病患者外周血T 細(xì)胞表達(dá)的意義及辛伐他汀的調(diào)節(jié)作用冠心病 (Coronary Heart Disease,CHD)是人類健康的主要?dú)⑹?。心臟病流行病學(xué)調(diào)查資料表明 , 隨著生活方式的改變 , 我國的 CHD患病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì) , 據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO)估計(jì)：到 2020 年左右 , 我國會(huì)迎來冠心病的 “流行”頂峰。動(dòng)脈粥樣硬化 (Atherosclerosis,AS)是冠心病發(fā)病的病理基礎(chǔ), 人們從500 年前埃及木乃伊的動(dòng)脈中就已發(fā)現(xiàn)粥樣硬化性病變。人類認(rèn)識(shí) AS是一種疾病并對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究已有100余年的歷史。有關(guān) AS的發(fā)病機(jī)制學(xué)說數(shù)量眾多, 其中

2、包括內(nèi)皮損傷學(xué)說、 脂質(zhì)浸潤學(xué)說、 血栓源性學(xué)說、動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖學(xué)說等。而自1999 年 Ross 提出 AS的炎癥反應(yīng)機(jī)制以來 ,AS 的炎癥反應(yīng)機(jī)制也已經(jīng)廣泛被醫(yī)學(xué)界認(rèn)可。研究證實(shí) , 炎癥參與了 AS形成及發(fā)展的各個(gè)階段 , 直至最終的血栓并發(fā)癥。而近年來 , 免疫因素在 AS的發(fā)生發(fā)展中的作用正在被人們認(rèn)識(shí)并引起重視, 更有學(xué)者提出 AS是一種自身免疫性疾病。在AS中 , 多種參與免疫細(xì)胞和炎癥因子構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的相互協(xié)同、相互影響的網(wǎng)絡(luò), 炎癥和免疫共同影響著AS的進(jìn)程。T 淋巴細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞, 參與特異性免疫反應(yīng) , 它與 AS的關(guān)系國際上已有不少研究。 AS的病理改變特

3、點(diǎn)為平滑肌細(xì)胞增殖、脂質(zhì)沉積、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成。在人類AS的各個(gè)時(shí)期都有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤 , 其中以 T 細(xì)胞為主?；顒?dòng)性斑塊與穩(wěn)定性斑塊比較,T 細(xì)胞顯著增加。許多關(guān)于人類和嚙齒目動(dòng)物的研究證實(shí) ,T 淋巴細(xì)胞促進(jìn)粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng), 影響損害的進(jìn)展及重塑。主要表現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：1.T 細(xì)胞與斑塊中其他免疫細(xì)胞及分子相互作用, 促進(jìn)粥樣硬化；2.T 細(xì)胞參與 ox-LDL 抗體、Hsp抗體等與 AS相關(guān)的自身抗體形成；3. 殺傷性 T 細(xì)胞溶解破壞巨噬細(xì)胞 , 釋放大量促粥樣硬化物質(zhì)； 4.T 細(xì)胞在不穩(wěn)定性斑塊形成及斑塊破裂中可能起一定作用。T 細(xì)胞活化是其發(fā)揮

4、病理生理作用的前提。 而 T 淋巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號(hào) , 第一個(gè)信號(hào)是 T 淋巴細(xì)胞表面的 TCR-CD3復(fù)合物同抗原遞呈細(xì)胞 (APC)上的MHC-類抗原肽復(fù)合物結(jié)合, 賦予免疫應(yīng)答的特異性, 但不引起T 細(xì)胞增生和分泌細(xì)胞因子；第二個(gè)信號(hào)是抗原非特異性的共刺激信號(hào), 由T 細(xì)胞上的共刺激分子與 APC表面的配體結(jié)合所誘導(dǎo) , 啟動(dòng)維持并調(diào)節(jié)活化級(jí)聯(lián)反應(yīng), 決定了 T細(xì)胞是活化增殖 , 或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡。重要的共刺激分子及其配基有：B7/CD28,血管細(xì)胞黏附分子 (VCAM)-1/ 遲現(xiàn)抗原 (VLA)-4, 細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1/ 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原 (LFA

5、)-1, LFA-3/CD2, CD40/CD40配基 ,CD70/CD27等。近年來 , 一些新的共刺激分子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn), 它們似乎在調(diào)節(jié)已活化的T 細(xì)胞反應(yīng)中有獨(dú)特的重要性。負(fù)性共刺激分子PD-1 (Programmed death-1) 和其配體PD-L (Programmed death-1 ligand)相互作用提供淋巴細(xì)胞活化的抑制信號(hào), 和正性共刺激信號(hào)形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò), 綜合調(diào)節(jié)免疫反應(yīng) , 在免疫活化和耐受中起關(guān)鍵作用。 PD-1 分子是免疫球蛋白超家族激活誘導(dǎo)的抑制性受體, 是擁有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM) 和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM) 的型跨膜蛋白

6、, 可誘導(dǎo)性表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞、 B 細(xì)胞、 NK細(xì)胞及骨髓細(xì)胞。PD-L1(B7-H1) 和 PD-L2(B7-DC)是 PD-1的兩個(gè)配體 ,PD-L1 主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞、單核 / 巨噬細(xì)胞、 B 細(xì)胞、激活的 T 細(xì)胞 , 在內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá) ,IFN- 、 可上調(diào)其表達(dá)。 PD-L2 在樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞上表達(dá) ,IL-4 、GM-CSF在體外強(qiáng)力誘導(dǎo)樹突細(xì)胞上PD-L2的表達(dá)。 PD-1-PD-L 結(jié)合后 , 發(fā)揮對(duì)效應(yīng) T 細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用 , 可抑制 T 細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子 IL-10 、IFN- 等。在免疫反應(yīng)的起始部位和效應(yīng)部

7、位雙重抑制免疫反應(yīng) , 防止過度的免疫損傷和自身免疫性疾病的發(fā)生, 有利于維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)。PD-1 負(fù)性共刺激信號(hào)的缺失會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性病變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示 ,PD-1 信號(hào)缺失導(dǎo)致小鼠發(fā)生類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及狼瘡樣自身免疫性腎炎, 導(dǎo)致 NOD小鼠自身免疫性糖尿病的快速進(jìn)展。增加 PD-1負(fù)性共刺激信號(hào)可使AS兔粥樣斑塊中 T 細(xì)胞浸潤減少及炎性反應(yīng)減輕 , 減輕實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎 (EAE)程度 , 使脊髓浸潤的巨噬細(xì)胞、CD4+、 CD8+T細(xì)胞消失。近年來研究者們對(duì)PD-1 在臨床疾病的表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn), 病毒感染 ( 如HBV、HIV) 、寄生蟲感染、移植免疫、自身免疫病( 如系統(tǒng)性紅斑

8、狼瘡、系統(tǒng)性硬化 ) 、腫瘤等多種疾病 , 都存在 PD-1 及其配體 PD-L 的表達(dá)異常 , 顯示出 PD-1 信號(hào)在對(duì)維持外周耐受及免疫自穩(wěn)方面起到保護(hù)性作用。 他汀作為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑 , 是有效的降脂藥物。除調(diào)脂作用之外 , 他汀還具有包括改善內(nèi)皮功能、增加 NO生物利用率、抗氧化、穩(wěn)定斑塊、調(diào)節(jié)祖細(xì)胞、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多重血管保護(hù)作用。其抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面的功效已在多種疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化的應(yīng)用中體現(xiàn)。 AS是一個(gè)慢性炎癥反應(yīng) , 且具有自身免疫的特點(diǎn) , 而 PD-1 在其中的作用機(jī)理尚不清楚。本研究通過對(duì)免疫負(fù)性調(diào)控信號(hào)分子PD-1 在

9、 CHD患者外周血 T 淋巴細(xì)胞(PBTC)的表達(dá)情況的檢測(cè) , 初步分析了其在AS發(fā)病及進(jìn)展中的意義； 利用特異性PD-1 阻斷抗體研究其對(duì)AS患者 PBTC的免疫學(xué)調(diào)節(jié)作用 , 進(jìn)一步推測(cè) PD-1 在 AS中的調(diào)控機(jī)制；并通過觀察辛伐他汀(Sim) 對(duì) PD-1 在 CHD患者 PBTC上的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 , 為 PD-1 作為 AS免疫學(xué)治療提供新的理論依據(jù)。第一部分：CHD患者PBTC上 PD-1 的表達(dá)目的：研究PD-1 在 CHD患者 PBTC上的表達(dá) , 初步探討其在AS發(fā)生發(fā)展中的意義。 方法：選擇 CHD患者 (55 例 ) 為研究對(duì)象 , 其中穩(wěn)定性心絞痛 (SA) 患者

10、 27 例, 急性冠脈綜合征 (ACS)患者 28 例,30 例經(jīng)冠脈造影證實(shí)的非CHD患者為正常對(duì)照組 , 密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),分別用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及RT-PCR檢測(cè) PD-1 蛋白及 mRNA在 T 淋巴細(xì)胞上的表達(dá)情況。結(jié)果：1. 直接免疫熒光觀察PD-1 蛋白表達(dá)于 PBTC的表面。2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PD-1蛋白表達(dá) PD-1在 PBTC上的表達(dá)在 SA患者組表達(dá)率為 (9.29 ±2.34)%,ACS患者組為 (8.19 ±2.36)%, 正常對(duì)照組為 (18.52 ±3.28)%。兩組 CHD患者的 PD-1表達(dá)率

11、低于正常對(duì)照組 , 差異具有顯著性P<0.001)。3.RT-PCR檢測(cè) PD-1mRNA在 PBTC的表達(dá) PD-1mRNA結(jié)果顯示 SA組患者表達(dá)量為 0.552 ±0.079,ACS 組為 0.477 ± 0.081, 均低于正常對(duì)照組的0.928 ±0.057(P<0.001)。結(jié)論： PD-1 在 CHD患者 PBTC上的表達(dá)明顯降低 , 這可能在AS的發(fā)生及發(fā)展中起到作用。第二部分PD-1 對(duì)體外培養(yǎng) CHD患者 PBTC的免疫學(xué)調(diào)控作用目的：研究PD-1 對(duì)體外培養(yǎng) CHD患者 PBTC的免疫學(xué)調(diào)控作用。方法：PBTC分離

12、與純化同前。 7 例 CHD患者和正常對(duì)照來自前一實(shí)驗(yàn)樣本人群。正常人及 CHD患者的 PBTC新鮮分離純化后 , 各分為 4 組, 與另一健康人來源的成熟樹突狀細(xì)胞 (mDC)以 20：1 比例混合 , 置于 37的 CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng) ,72小時(shí)后收集各組上清液ELISA 法檢測(cè) IFN- 、IL-4 。3H-胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR) 摻入率反映 T 淋巴細(xì)胞的 DNA合成。實(shí)驗(yàn)分組：1)PBTC組：PBTC加等體積的 PBS作為陰性對(duì)照組； 2)PBTC+mDC組： PBTC與 mDC共培養(yǎng)； 3)PBTC+mDC+PD-1Ig組： PBTC與 mDC共培養(yǎng)體系中加入鼠抗人PD-1

13、 抗體 ( 終濃度為 10g/ml) ；4)PBTC+mDC+Ig組： PBTC與 mDC共培養(yǎng)體系中加入鼠抗人同型對(duì)照 Ig( 終濃度為 10 g/ml) 。結(jié)果： 1.PD-1 共刺激分子對(duì) CHD患者和正常人 PBTC增殖作用的影響：正常對(duì)照及 CHD患者不同處理組之間差異有顯著性意義 (P<0.001)。PBTC+mDC+PD-1Ig組 3H-TdR摻入率較 PBTC+mDC組增加有顯著性意義(P<0.001),而加入同型對(duì)照抗體則無變化(P>0.05)。析因方差分析顯示 ,CHD患者組 PD-1 阻斷后 ,PBTC增殖程度低于對(duì)照組 , 即

14、PD-1 分子抑制 T 細(xì)胞增殖的作用減弱。 2.PD-1 共刺激分子對(duì) CHD患者和正常人 PBTC分泌細(xì)胞因子作用的影響：正常對(duì)照及 CHD患者 PBTC組、 PBTC+mDC組、 PBTC+mDC+PD-1Ig組和PBTC+mDC+Ig組的 IFN- 、IL-4 表達(dá)量組間差異具有顯著性。LSD比較分析表明 ,PBTC+mDC組比 PBTC組 IFN- 和 IL-4 分泌增加有顯著性意義 ( 均 P<0.001)；在 PBTC+mDC組加入 PD-1-Ig 后,IFN- 和 IL-4 分泌均增加 , 有顯著性意義 ( 均 P<0.001),而加入同型對(duì)照抗體則

15、變化無顯著性意義(P>0.05)。析因方差分析顯示 ,CHD患者組 PD-1 阻斷后 , 細(xì)胞因子產(chǎn)生增加程度低于對(duì)照組 , 即 PD-1 抑制 T 細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用減弱。結(jié)論：CHD患者及正常人體內(nèi) PD-1共刺激分子在抑制PBTC增殖與分泌 IFN- 和 IL-4 發(fā)揮著重要的作用。CHD患者較正常人比較這種抑制作用相對(duì)減弱。第三部分辛伐他汀對(duì)PD-1在 CHD患者 PBTC表達(dá)的調(diào)節(jié)作用目的：觀察辛伐他汀(Sim) 對(duì) PD-1 在 CHD患者PBTC表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 , 初步探討他汀藥物的免疫學(xué)調(diào)節(jié)AS的新機(jī)制。方法：取12 例 CHD患者新鮮外周血15ml, 密度梯度離心法得到PBMC,并分為 3 個(gè)組：取分離出的 CHD患者 PBMC,同一患者細(xì)胞再分為空白對(duì)照組與Sim 組：分別加入等體積的 PBS與 Sim( 終濃度分別為 10-6mol/L 和 10-5mol/L) 。24 小時(shí)小時(shí)后收集細(xì)胞 , 洗滌并調(diào)整濃度為