CCK原理優(yōu)勢步驟

1、檢測原理： ? Cell Counting Kit 簡稱 CCK試劑盒，是一種基于 WST-8（化學名： 2-(2- 甲氧基-4- 硝苯基 )-3-(4-硝苯基 )-5-(2,4-二磺基苯 )-2H- 四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8 屬于 MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（ formazan ）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在 450mM波長處測定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。 CCK法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性

2、測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。CCK方法的優(yōu)勢： ? 表 1 CCK法與其他細胞增殖/ 毒性檢測方法的優(yōu)勢比較檢測方法MTT法XTT法WST-1法CCK法甲臜產(chǎn)物的水差（需加有機溶劑溶解好好好溶性再檢測）產(chǎn)品性狀粉末2 瓶溶液溶液1 瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開即用即開即用檢測靈敏度高很高很高高檢測時間較長較短較短最短檢測波長560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm很低，細胞形很低，細胞形很低，細胞形細胞毒性高，細胞形態(tài)完全消失態(tài)不變態(tài)不變態(tài)不變試劑穩(wěn)定性一般較差一般很好批量樣品檢測可以非常適合非常適合非常適合便捷程度一般便捷便捷非常便

3、捷 酚紅和血清對CCK法的檢測不會造成干擾； 細胞毒性非常低， 因此加入 WST-8顯色后， 可以在不同時間反復用酶標儀讀數(shù)從而找到最佳測定時間。CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請見說明書）：實驗一：細胞活性檢測1、在 96 孔板中接種細胞懸液 （ 100 L/ 孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（ 37 ,5%CO2）。2、向每孔加入10 L CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 小時。4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。5、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 L 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板

4、避光保存在室溫條件下。24 小時內(nèi)測定， 吸光度不會發(fā)生變化。實驗二：細胞增殖- 毒性檢測1、在 96 孔板中配置100 L 的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 小時（ 37，5% CO2）。2、向培養(yǎng)板加入10L 不同濃度的待測物質(zhì)。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6、12、24 或 48 小時）。4、向每孔加入10 L CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 小時。6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。7、若暫時不測定 OD值，可以向每孔中加入溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。10 L 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS24 小時內(nèi)測定， 吸光度不會發(fā)生變化。注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可?；盍τ嬎悖杭毎盍?* （） =A( 加藥 )-A （空白） /A （ 0 加藥） -A （空白） × 100A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度A（