遺傳學實驗ppt

1、遺傳學實驗遺傳學實驗1.1.果蠅的培養(yǎng)、形態(tài)觀察及整體裝片的制作果蠅的培養(yǎng)、形態(tài)觀察及整體裝片的制作2.2.果蠅的伴性遺傳果蠅的伴性遺傳3.3.果蠅巨染色體的制片和觀察果蠅巨染色體的制片和觀察4.4.從口腔脫落細胞中提取人類基因組從口腔脫落細胞中提取人類基因組DNA DNA 5.PCR5.PCR法鑒定人法鑒定人SRYSRY基因基因6.6.學生自主創(chuàng)新性實驗學生自主創(chuàng)新性實驗微核檢測技術微核檢測技術 7.7.熒光定量熒光定量PCRPCR檢測煙草刺激后人肺細胞檢測煙草刺激后人肺細胞ERCC4ERCC4基因和基因和GAPDHGAPDH基因的表達變化基因的表達變化 8.8.人類人類ACEACE基因多態(tài)

2、檢測及其與耐力運動能基因多態(tài)檢測及其與耐力運動能力的關聯(lián)分析力的關聯(lián)分析注意安全！注意安全！v1.1.穿實驗服。穿實驗服。v2.2.各項操作務必規(guī)范，小心謹慎。對有各項操作務必規(guī)范，小心謹慎。對有毒有害物質(zhì)進行操作時，要做好防護。毒有害物質(zhì)進行操作時，要做好防護。v3.3.避免在實驗室吃喝食物。避免在實驗室吃喝食物。v4.4.遵守實驗室其他安全守則。遵守實驗室其他安全守則。實驗報告格式實驗報告格式v實驗名稱實驗名稱 實驗人員姓名實驗人員姓名 學號學號 實驗時間實驗時間v一、實驗目的一、實驗目的v二、實驗原理二、實驗原理v三、實驗步驟三、實驗步驟v四、實驗結(jié)果四、實驗結(jié)果實驗一實驗一果蠅的培養(yǎng)、

3、形態(tài)觀察及整體裝片果蠅的培養(yǎng)、形態(tài)觀察及整體裝片的制作的制作（一）果蠅的生活史（一）果蠅的生活史昆蟲綱，雙翅目。昆蟲綱，雙翅目。2525下，下，1212天完成一個周天完成一個周期期 ：卵：卵幼蟲幼蟲蛹蛹成蟲。成體果蠅可活成蟲。成體果蠅可活幾周。幾周。卵卵幼蟲幼蟲蛹蛹成蟲成蟲雌雄果蠅的主要雌雄果蠅的主要形態(tài)特征形態(tài)特征性狀性狀雌蠅雌蠅雄蠅雄蠅體型體型較大較大較小較小腹部末端腹部末端腹端尖腹端尖腹端鈍腹端鈍背部黑色橫紋背部黑色橫紋7條條(可見可見5條條)5條條(可見可見3條條)腹片數(shù)腹片數(shù)6片片4 片片性梳性梳無無有、位于前足附節(jié)上有、位于前足附節(jié)上（二）果蠅的培養(yǎng)及雜交（二）果蠅的培養(yǎng)及雜交 1

4、 1、果蠅培養(yǎng)時常用的培養(yǎng)基、果蠅培養(yǎng)時常用的培養(yǎng)基2 2、果蠅的麻醉、果蠅的麻醉 首先，將培養(yǎng)瓶棉塞上的果蠅驅(qū)到瓶底，打開首先，將培養(yǎng)瓶棉塞上的果蠅驅(qū)到瓶底，打開培養(yǎng)瓶與麻醉瓶的瓶塞，迅速使兩瓶口對接，培養(yǎng)瓶與麻醉瓶的瓶塞，迅速使兩瓶口對接，將培養(yǎng)瓶中部分果蠅驅(qū)入麻醉瓶中，迅速塞上將培養(yǎng)瓶中部分果蠅驅(qū)入麻醉瓶中，迅速塞上棉塞，防止果蠅的種群污染，拔開麻醉瓶棉塞，棉塞，防止果蠅的種群污染，拔開麻醉瓶棉塞，以其側(cè)面遮蓋麻醉瓶口，再棉塞中央滴幾滴乙以其側(cè)面遮蓋麻醉瓶口，再棉塞中央滴幾滴乙醚，塞上棉塞，等果蠅麻醉。（果蠅翅膀外層醚，塞上棉塞，等果蠅麻醉。（果蠅翅膀外層4545度角表死亡）度角表死亡）

5、3 3、果蠅的轉(zhuǎn)接、果蠅的轉(zhuǎn)接被麻醉果蠅移入飼養(yǎng)瓶中，將瓶橫臥置放，被麻醉果蠅移入飼養(yǎng)瓶中，將瓶橫臥置放，否則未醒果蠅粘著于飼料會溺死。待果蠅蘇否則未醒果蠅粘著于飼料會溺死。待果蠅蘇醒后再將瓶直立，貼上標簽，放入培養(yǎng)箱。醒后再將瓶直立，貼上標簽，放入培養(yǎng)箱。、處女果蠅的選取、處女果蠅的選取 雌果蠅受精囊內(nèi)可貯存大量的精子，因此雌果蠅受精囊內(nèi)可貯存大量的精子，因此在做品系間雜交時，母本必須選用處女蠅。在做品系間雜交時，母本必須選用處女蠅。雌蠅孵出雌蠅孵出12小時后才會交配（小時后才會交配（8小時更為可小時更為可靠），所以將老果蠅清除后，靠），所以將老果蠅清除后，12小時內(nèi)所小時內(nèi)所收集到的雌蠅就

6、是處女蠅。收集到的雌蠅就是處女蠅。（三）果蠅整體裝片的制作（三）果蠅整體裝片的制作、制片：取輕度麻醉的雌雄果蠅各一只放在、制片：取輕度麻醉的雌雄果蠅各一只放在載玻片上，待果蠅將醒能動時，滴一滴樹膠載玻片上，待果蠅將醒能動時，滴一滴樹膠在果蠅上，蓋上蓋玻片，讓蓋片自然沉降，在果蠅上，蓋上蓋玻片，讓蓋片自然沉降，要防止氣泡產(chǎn)生。滴樹膠的量以浸沒果蠅，要防止氣泡產(chǎn)生。滴樹膠的量以浸沒果蠅，蓋上蓋片不外漏為度。蓋上蓋片不外漏為度。、觀察：果蠅的背部橫紋、雄果蠅的性梳。、觀察：果蠅的背部橫紋、雄果蠅的性梳。（四）作業(yè)（四）作業(yè)制作一張良好的裝片，要求能夠看到果蠅的背制作一張良好的裝片，要求能夠看到果蠅的

7、背部橫紋及性梳。部橫紋及性梳。實驗二實驗二果蠅的伴性遺傳實驗果蠅的伴性遺傳實驗 一、實驗目的一、實驗目的 v了解伴性遺傳和非伴性遺傳的區(qū)別，了解伴了解伴性遺傳和非伴性遺傳的區(qū)別，了解伴性遺傳基因在正、反雜交中的差異。性遺傳基因在正、反雜交中的差異。v掌握基本的遺傳結(jié)果記錄及統(tǒng)計處理方法。掌握基本的遺傳結(jié)果記錄及統(tǒng)計處理方法。二、實驗原理二、實驗原理 三、實驗步驟三、實驗步驟1、雜交組合親本設計、雜交組合親本設計正交：紅眼雌蠅正交：紅眼雌蠅(處女蠅處女蠅)白眼雄蠅白眼雄蠅反交：白眼雌蠅反交：白眼雌蠅(處女蠅處女蠅)紅眼雄蠅紅眼雄蠅反交方法：反交方法： (a)把紅眼果蠅倒出麻醉，仔細挑出只雄蠅，移

8、到把紅眼果蠅倒出麻醉，仔細挑出只雄蠅，移到上述雜交瓶中，貼好標簽。上述雜交瓶中，貼好標簽。 (b) 把白眼雌蠅（處女蠅）倒出麻醉，挑只移到雜把白眼雌蠅（處女蠅）倒出麻醉，挑只移到雜交瓶中交瓶中。 (c)等雜交親本在雜交瓶中全部蘇醒后，將雜交瓶移等雜交親本在雜交瓶中全部蘇醒后，將雜交瓶移入入25溫箱中培養(yǎng)。溫箱中培養(yǎng)。2、第二周，倒去雜交親本果蠅。、第二周，倒去雜交親本果蠅。3、第三周，觀察、第三周，觀察F1眼睛顏色。將眼睛顏色。將F1全部倒全部倒出，輕度麻醉，觀察出，輕度麻醉，觀察F1成蠅，記載正反交成蠅，記載正反交結(jié)果結(jié)果 。觀察后，將。觀察后，將F1果蠅全部移入一新培果蠅全部移入一新培養(yǎng)瓶

9、（這里不需用處女蠅）置養(yǎng)瓶（這里不需用處女蠅）置25溫箱中溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)。4、第四周，倒去、第四周，倒去F1親本。親本。5、第五周，觀察、第五周，觀察F2成蠅眼睛顏色。被統(tǒng)計成蠅眼睛顏色。被統(tǒng)計過的果蠅處理掉。過的果蠅處理掉。四、實驗記錄及結(jié)果分析四、實驗記錄及結(jié)果分析X X2 2檢驗（檢驗（ F2F2） 實驗三實驗三 果蠅巨染色體的制片與觀察果蠅巨染色體的制片與觀察一一 實驗目的實驗目的1、練習果蠅幼蟲的解剖技術及果蠅唾、練習果蠅幼蟲的解剖技術及果蠅唾腺染色體的制片方法腺染色體的制片方法2、觀察果蠅的唾腺染色體、觀察果蠅的唾腺染色體二二 實驗原理實驗原理 唾腺染色體是一類存在于雙翅目昆蟲幼

10、蟲唾腺染色體是一類存在于雙翅目昆蟲幼蟲唾液腺內(nèi)的巨大染色體，由于染色體唾液腺內(nèi)的巨大染色體，由于染色體DNA經(jīng)過經(jīng)過多次復制，但并未發(fā)生細胞核分裂，重復復制多次復制，但并未發(fā)生細胞核分裂，重復復制后的染色線聚集在一起，因此比一般的染色體后的染色線聚集在一起，因此比一般的染色體大得多。同時，唾腺細胞中的同源染色體總是大得多。同時，唾腺細胞中的同源染色體總是處于配對狀態(tài)，因此在果蠅唾腺細胞只能看到處于配對狀態(tài)，因此在果蠅唾腺細胞只能看到體細胞染色體數(shù)目的一半。體細胞染色體數(shù)目的一半。 研究證明，多線染色體的帶紋與某些特定研究證明，多線染色體的帶紋與某些特定的基因相聯(lián)系，由于多線染色體上的帶紋清晰的

11、基因相聯(lián)系，由于多線染色體上的帶紋清晰可數(shù)，因此巨染色體是遺傳學上研究染色體形可數(shù)，因此巨染色體是遺傳學上研究染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色體畸變的好材料。態(tài)結(jié)構(gòu)和染色體畸變的好材料。三三 實驗步驟實驗步驟 1、取材、取材(三齡幼蟲，三齡幼蟲，5mm) 取一張載玻片放在雙筒解剖鏡下，滴一滴生理鹽水，取一張載玻片放在雙筒解剖鏡下，滴一滴生理鹽水，將幼蟲放在生理鹽水內(nèi)。兩手各握一枚解剖針，一將幼蟲放在生理鹽水內(nèi)。兩手各握一枚解剖針，一枚釘住幼蟲末端的枚釘住幼蟲末端的1/3處固定幼蟲，另一枚解剖針釘處固定幼蟲，另一枚解剖針釘住幼蟲頭部，前拉，把頭部自身體拉開，可看到唾住幼蟲頭部，前拉，把頭部自身體拉開，可看到

12、唾腺，剔除唾腺周圍的脂肪及其它物質(zhì)。腺，剔除唾腺周圍的脂肪及其它物質(zhì)。 2、固定染色、固定染色 吸去生理鹽水，滴數(shù)滴鹽酸，水解分鐘，吸去生理鹽水，滴數(shù)滴鹽酸，水解分鐘，使組織疏松，以便壓片時細胞分散，染色體使組織疏松，以便壓片時細胞分散，染色體散開。散開。 吸去鹽酸，加吸去鹽酸，加1滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干，滴蒸餾水輕輕沖洗后吸干，滴滴12滴醋酸洋紅染液，固定染色滴醋酸洋紅染液，固定染色1020分分鐘。鐘。3.3.制片制片 染色完成后，蓋上蓋玻片壓片，然后用吸水染色完成后，蓋上蓋玻片壓片，然后用吸水紙包被玻片，吸干多余染色液，并用手指輕壓紙包被玻片，吸干多余染色液，并用手指輕壓蓋玻片，再用鉛筆的

13、橡皮頭或解剖針柄垂直輕蓋玻片，再用鉛筆的橡皮頭或解剖針柄垂直輕敲，或進一步用拇指在蓋玻片上適當用力壓片，敲，或進一步用拇指在蓋玻片上適當用力壓片，注意勿使蓋玻片移動。注意勿使蓋玻片移動。4.4.觀察觀察 將制片置低倍鏡下找到分散好的標本，移至將制片置低倍鏡下找到分散好的標本，移至視野中心，然后轉(zhuǎn)到高倍鏡下觀察。對染色體視野中心，然后轉(zhuǎn)到高倍鏡下觀察。對染色體分散、個體性清楚的片子，應仔細觀察染色體分散、個體性清楚的片子，應仔細觀察染色體的橫紋數(shù)量、形狀和排列順序，以便對照模式的橫紋數(shù)量、形狀和排列順序，以便對照模式照片辨認出不同的染色體臂。照片辨認出不同的染色體臂。 一般在一個唾腺細胞中能看到

14、一般在一個唾腺細胞中能看到5條長臂的染色體，分條長臂的染色體，分別為別為X染色體、第二對染色體的左臂（染色體、第二對染色體的左臂（L）、右臂）、右臂（R）、第三對染色體的左臂（）、第三對染色體的左臂（L）、右臂（）、右臂（R），），這這5條染色體臂由條染色體臂由染色中心染色中心發(fā)射出來。這是由于第發(fā)射出來。這是由于第四對染色體相當小看不清，四對染色體相當小看不清，Y染色體濃縮，染色體濃縮，X染色體染色體的著絲點位于端部只有一條臂之故。的著絲點位于端部只有一條臂之故。四四 作業(yè)作業(yè)v制作果蠅巨染色體裝片制作果蠅巨染色體裝片v畫出你所觀察到的果蠅巨染色體，并加畫出你所觀察到的果蠅巨染色體，并加以標

15、注與描述。以標注與描述。 實驗四實驗四 從口腔脫落細胞中提取從口腔脫落細胞中提取人類基因組人類基因組DNA實驗目的實驗目的1、了解從細胞中提取、了解從細胞中提取DNA的基本原理的基本原理2、學習從口腔脫落細胞中提取高分子量、學習從口腔脫落細胞中提取高分子量DNA的基本操作步驟和會影響提取效果的注意事的基本操作步驟和會影響提取效果的注意事項。項。實驗原理實驗原理DNADNA提取的方法：提取的方法：濃鹽法濃鹽法陰離子去污劑法陰離子去污劑法苯酚抽提法苯酚抽提法水抽提法水抽提法金屬螯合樹脂抽提法金屬螯合樹脂抽提法破壞細胞的細胞膜，釋放出破壞細胞的細胞膜，釋放出DNA。1.用蛋白酶用蛋白酶K（使膜上蛋白

16、（使膜上蛋白變性分解）和去污劑變性分解）和去污劑SDS（破壞細胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)）（破壞細胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)）共同消化細胞。共同消化細胞。2.然后酚、氯仿等有機溶劑然后酚、氯仿等有機溶劑進行抽提，進行進行抽提，進行DNA的純化，的純化，去掉蛋白質(zhì)、去掉蛋白質(zhì)、RNA、多糖等、多糖等生物大分子。生物大分子。3.最后用無水乙醇沉淀最后用無水乙醇沉淀DNA，干燥后用干燥后用TE溶解，在溶解，在4下下可保存一年。可保存一年。實驗步驟實驗步驟1、先用清水漱口。然后用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙、先用清水漱口。然后用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復漱口；將唾刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復漱口；將

17、唾液吐到杯中。用液吐到杯中。用1ml生理鹽水洗滌，后將生理鹽水洗滌，后將1.5ml液液體轉(zhuǎn)入體轉(zhuǎn)入1個干凈的個干凈的EP管中，管中，2000rpm離心離心5分鐘，分鐘，倒掉上清。倒掉上清。2、重復用、重復用1.0ml生理鹽水洗滌沉淀生理鹽水洗滌沉淀1次，離心，去上次，離心，去上清。清。3、沉淀中加、沉淀中加500l 1x細胞裂解液（細胞裂解液（STE），打散細胞），打散細胞團、混勻，再加團、混勻，再加15l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，充分混，充分混勻。勻。 55水浴水浴30min。4、加、加500l飽和飽和酚，輕搖混勻，室溫酚，輕搖混勻，室溫12000rpm離離心心10min。5、上清（注

18、意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及、上清（注意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及下層有機相）移至另一加入裝有下層有機相）移至另一加入裝有500l氯仿的氯仿的EP管，輕搖混勻，室溫管，輕搖混勻，室溫12000rpm離心離心10min。6、吸取、吸取400l上清上清（注意不要吸到中間層白色絮狀（注意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及下層有機相）至已裝有物質(zhì)以及下層有機相）至已裝有900 l預冷無水預冷無水乙醇的離心管，混合均勻，可見白色絮狀沉淀，乙醇的離心管，混合均勻，可見白色絮狀沉淀，10000rpm離心離心5min，DNA沉淀在管底。沉淀在管底。7 、 去 上 清 ， 加 入、 去 上 清 ， 加 入

19、7 0 % 乙 醇乙 醇 1 m l 清 洗 沉 淀 ，清 洗 沉 淀 ，10000rpm離心離心5min，去上清（盡量用小槍頭，去上清（盡量用小槍頭將液體去干凈，但注意不要將沉淀也吸走），將液體去干凈，但注意不要將沉淀也吸走），室溫干燥室溫干燥5min，再用，再用50l TE buffer溶解沉淀，溶解沉淀，4儲藏備用。儲藏備用。DNA純度和濃度鑒定純度和濃度鑒定紫外分光光度計測紫外分光光度計測OD值、瓊脂糖凝膠電泳檢測。值、瓊脂糖凝膠電泳檢測。1 OD260=0.05g/l DNA純品純品DNA： OD260/OD280=1.8 1.8 有有RNA 1.8 有蛋白有蛋白瓊脂糖凝膠電泳，可以

20、看到一條基因組瓊脂糖凝膠電泳，可以看到一條基因組DNA條帶。條帶。作業(yè)作業(yè)v提取人類口腔脫落細胞基因組提取人類口腔脫落細胞基因組DNA。實驗五實驗五 PCRPCR法鑒定人法鑒定人SRYSRY基因基因?qū)嶒災康膶嶒災康?.1.認識性別決定基因認識性別決定基因SRYSRY，了解生物的性，了解生物的性別是由基因決定的。別是由基因決定的。2.2.了解了解PCRPCR方法鑒定基因的原理及步驟。方法鑒定基因的原理及步驟。42實驗原理實驗原理SRYSRY基因在哺乳動物的性別分化過程中起著決基因在哺乳動物的性別分化過程中起著決定性的作用，該基因只存在于雄性個體中。以定性的作用，該基因只存在于雄性個體中。以人為研

21、究對象，對人為研究對象，對SRYSRY基因進行基因進行PCRPCR擴增，若測擴增，若測試者是男性，樣本中存在該基因，測試結(jié)果為試者是男性，樣本中存在該基因，測試結(jié)果為陽性；女性測試者則會相應得到陰性結(jié)果。陽性；女性測試者則會相應得到陰性結(jié)果。人人SRYSRY基因位于基因位于Yp11.3Yp11.3，只含有，只含有一個外顯子，沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)一個外顯子，沒有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長約錄單位長約1.1kb1.1kb，編碼一個，編碼一個204204氨基酸的蛋白質(zhì)。氨基酸的蛋白質(zhì)。實驗步驟實驗步驟（一）獲取口腔脫落細胞，提?。ㄒ唬┇@取口腔脫落細胞，提取DNA（二）（二）PCR擴增擴增SRY基因基因（三）電泳檢

22、測（三）電泳檢測SRY基因基因 （SRY基因擴增條帶大小約為基因擴增條帶大小約為420bp。）。）PCRPCR反應體系（共反應體系（共25ul 25ul ） 10X10X緩沖液：緩沖液： 2.5ul2.5ul 引物：引物： 各各0.5ul0.5ul dNTP dNTP： 0.5ul0.5ul TapDNA TapDNA聚合酶：聚合酶： 0.5ul 0.5ul Mg Mg離子溶液：離子溶液： 1.5ul1.5ul 模板模板DNADNA： 2ul2ul ddH2O ddH2O： 17ul17ulvPCR實驗反應實驗反應 （35個循環(huán)）個循環(huán)） 94 5min 94 30s 55 30s 72 30

23、s 72 5min作業(yè)作業(yè)vPCR擴增擴增SRY基因，觀察電泳結(jié)果是否與性基因，觀察電泳結(jié)果是否與性別相符合。別相符合。實驗六實驗六 微核檢測技術微核檢測技術（自主創(chuàng)新實驗）（自主創(chuàng)新實驗）一、實驗目的一、實驗目的1. 了解微核檢測技術原理和毒理遺傳學意義。2.培養(yǎng)實驗設計能力及解決各類問題的能力。二、實驗原理二、實驗原理微核（微核（micronucleusmicronucleus， 簡稱簡稱MCNMCN）也稱衛(wèi)星核，是細胞在分裂時因各種有害因素如輻也稱衛(wèi)星核，是細胞在分裂時因各種有害因素如輻射、化學藥劑的所帶來的損傷，使細胞核成份殘留射、化學藥劑的所帶來的損傷，使細胞核成份殘留在核外的微小核

24、染色質(zhì)塊，類似細胞核，游離于主在核外的微小核染色質(zhì)塊，類似細胞核，游離于主核之外，呈圓形或橢圓形，但體積較小，大小應在核之外，呈圓形或橢圓形，但體積較小，大小應在主核主核1/31/3以下。一般認為以下。一般認為 ，微核由染色體斷片和滯，微核由染色體斷片和滯留染色體組成。這些斷片或染色體在分裂過程中行留染色體組成。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊。當細胞周期進入到下一次分裂間期時，之外的核塊。當細胞周期進入到下一次分裂間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。它們便濃縮成主核之外的小核，即形成

25、了微核。 通過微核檢測技術，可同時檢測染通過微核檢測技術，可同時檢測染色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不平衡、基因擴增、不分離、平衡、基因擴增、不分離、DNADNA損傷損傷修復障礙、修復障礙、HPRTHPRT基因突變、凋亡、細基因突變、凋亡、細胞分裂不平衡等多種遺傳學終點，可胞分裂不平衡等多種遺傳學終點，可以用來評估某種環(huán)境因素是否具有誘以用來評估某種環(huán)境因素是否具有誘變性。變性。 蠶豆根尖微核檢測蠶豆根尖微核檢測泥鰍血紅細胞微核檢測泥鰍血紅細胞微核檢測三、實驗步驟三、實驗步驟蠶豆根尖微核檢測蠶豆根尖微核檢測 蠶豆蠶豆:根尖細胞的染色體大，根尖細胞的染色體大，DN

26、A含量高，對誘含量高，對誘變因反應敏感，便于觀察。變因反應敏感，便于觀察。v蠶豆：實驗材料的培養(yǎng)蠶豆：實驗材料的培養(yǎng)實驗處理（用選擇的誘變實驗處理（用選擇的誘變劑處理劑處理2天）天）根尖細胞恢復培養(yǎng)根尖細胞恢復培養(yǎng)固定固定酸解酸解染染色色結(jié)果觀察結(jié)果觀察用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩次，每次用蒸餾水浸洗固定好的幼根兩次，每次3-5分鐘，吸分鐘，吸凈水，加入凈水，加入5mol/L鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解5-10分鐘，視幼根軟化程度而定，幼根軟化即可。分鐘，視幼根軟化程度而定，幼根軟化即可。吸去鹽酸，用水浸沒幼根三次，每次吸去鹽酸，用水浸沒幼根三次，每次12分鐘。最分鐘。最

27、后浸于水中。后浸于水中。制片時，將幼根放置于載玻片上，截下制片時，將幼根放置于載玻片上，截下12mm左左右長的根尖，滴一滴醋酸洋紅染液，染色右長的根尖，滴一滴醋酸洋紅染液，染色58分鐘。分鐘。蓋上蓋玻片，觀察。蓋上蓋玻片，觀察。圖圖1. 1. 蠶豆根尖細胞微核觀察圖（上方兩圖為染色體斷裂片段，下方兩圖為微核）蠶豆根尖細胞微核觀察圖（上方兩圖為染色體斷裂片段，下方兩圖為微核）泥鰍血紅細胞微核檢測泥鰍血紅細胞微核檢測v泥鰍：實驗材料的培養(yǎng)泥鰍：實驗材料的培養(yǎng)實驗處理（用選擇實驗處理（用選擇的誘變劑處理的誘變劑處理2天）天）制片制片染色染色結(jié)果觀察。結(jié)果觀察。用剪刀或刀片斷尾取泥鰍外周血于載玻片上，

28、用剪刀或刀片斷尾取泥鰍外周血于載玻片上，用一潔凈的載玻片迅速從一端向另一端刮去。用一潔凈的載玻片迅速從一端向另一端刮去。晾干后先用瑞氏染液染晾干后先用瑞氏染液染1min，然后用水洗去，然后用水洗去瑞氏染液，再用磷酸緩沖液稀釋瑞氏染液，再用磷酸緩沖液稀釋10倍后的姬倍后的姬母薩染液染母薩染液染 15 min ，水洗，晾干即可用顯，水洗，晾干即可用顯微鏡觀察。微鏡觀察。 a a 正常紅細胞正常紅細胞 b b正常細胞核均等分裂正常細胞核均等分裂 c c正常細胞的均等分裂正常細胞的均等分裂 d d 核變形核變形 e e 核變形核變形 f f 核不均等縊縮核不均等縊縮泥鰍血紅細胞的血涂片圖泥鰍血紅細胞的

29、血涂片圖-1 泥鰍血紅細胞的血涂片圖泥鰍血紅細胞的血涂片圖-2 g g 微核微核 h h 微核微核 i i細胞不均等分裂細胞不均等分裂 j j 細胞不均等分裂細胞不均等分裂 k k 細胞開始凋亡細胞開始凋亡 l l細胞裂解細胞裂解作業(yè)作業(yè)蠶豆：每一處理至少觀察蠶豆：每一處理至少觀察3個根尖，每個根尖數(shù)個根尖，每個根尖數(shù)1000個細胞，計算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。個細胞，計算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。泥鰍：每處理泥鰍：每處理3個重復，每重復統(tǒng)計個重復，每重復統(tǒng)計1000個細胞個細胞 ，計，計算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。算微核數(shù)、污染指數(shù)，判斷污染程度。微核率微核率= = 微核

30、細胞數(shù)觀察細胞總數(shù)微核細胞數(shù)觀察細胞總數(shù) 1000 1000 污染指數(shù)（污染指數(shù)（PIPI）= =樣品實測樣品實測MCNMCN平均值平均值/ /對照組對照組MCNMCN平平均值均值實驗七實驗七 熒光定量熒光定量PCRPCR檢測煙草刺激后人檢測煙草刺激后人肺細胞肺細胞ERCC4ERCC4基因和基因和GAPDHGAPDH基因的基因的表達變化表達變化實驗目的實驗目的1.了解基因表達與環(huán)境的關系了解基因表達與環(huán)境的關系2.了解熒光定量了解熒光定量PCR技術的原理和基本步技術的原理和基本步驟驟3.研究吸煙刺激后肺細胞基因表達的變化研究吸煙刺激后肺細胞基因表達的變化實驗原理：實驗原理：u 實時熒光定量實時

31、熒光定量PCR是在是在PCR 技術基礎上發(fā)展起技術基礎上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術。它是在來的一種高度靈敏的核酸定量技術。它是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號來實時反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。板濃度進行定量分析。u ERCC4：在：在DNA損傷修復中的重要功能。損傷修復中的重要功能。 GAPDH：甘油醛：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，在不同條件下，磷酸脫氫酶，在不同條件下，GAPDH的表達相對穩(wěn)定，可作為內(nèi)參照。的表達相對穩(wěn)定，可作為內(nèi)參照。u 在本次實驗中，我們

32、將利用實時熒光定量在本次實驗中，我們將利用實時熒光定量PCR分析在吸煙刺激下，分析在吸煙刺激下，ERCC4基因的表達變化。基因的表達變化。Threshold lineC(t) value 閾值閾值：熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定的一個熒光強度標準 C(t)C(t)值值：熒光信號到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。 在實時熒光定量PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。擴增階段：擴增階段： 指數(shù)期指數(shù)期 平臺期平臺期

33、兩種定量方法v絕對定量 標準曲線法v相對定量 雙標準曲線法 2 2 -c(t)-c(t) 法法實驗步驟：實驗步驟：一、樣品準備（已完成）一、樣品準備（已完成）1、CSE（香煙煙霧提取物）的制備（香煙煙霧提取物）的制備2、HELF細胞（人胚肺成纖維細胞）的培養(yǎng)細胞（人胚肺成纖維細胞）的培養(yǎng)3、CSE處理處理HELF細胞細胞4、總、總RNA的抽提的抽提5、逆轉(zhuǎn)錄生成、逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA二、二、Realtime PCR反應反應1.Realtime PCR反應體系配置：反應體系配置：2 Syber green PCR MasterMix 10 l10uM 的的PCR特異引物特異引物10.5 l10uM 的的PCR特異引物特異引物20.5 l樣品樣品 1 lH2O 8ul 總體積為總體積為 20 l輕彈管底將溶液混合，輕彈管底將溶液混合，5000 rpm短暫離心。短暫離心。2.將上述將上述PCR反應溶液置于反應溶液置于Realtime PCR儀上進儀上進行行PCR反應。反應。 GAPDH、 ERCC4 反應溫度：反應溫度： 95，5min；30個個PCR循環(huán)（循環(huán)（95，30秒；秒；55，30秒；秒；72，30秒；（收