實(shí)驗(yàn)酵母醇脫氫酶的提純及其性質(zhì)的研究

1、實(shí)驗(yàn)三 酵母醇脫氫酶的提純及其性質(zhì)的研究醇脫氫酶（ADH）是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一，在生物催化、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用。生物體內(nèi)的很多醇類代謝都是通過醇脫氫酶催化完成的。醇脫氫酶來源廣泛，種類繁多，可按肽鏈長度分為短鏈、中鏈、長鏈醇脫氫酶，所含肽鏈氨基酸殘基數(shù)分別為250、375和600750，酵母醇脫氫酶（YADH）是其中研究和應(yīng)用最為廣泛的一種。酵母醇脫氫酶以NAD+/NADH為輔酶，可逆催化醇和醛/酮之間的氧化還原反應(yīng)。酵母醇脫氫酶為四聚體，單個(gè)亞基肽鏈含347個(gè)氨基酸殘基，亞基相對(duì)分子質(zhì)量為35 000。（一）酵母醇脫氫酶的提純一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)和掌握醇脫氫酶提純

2、的原理和方法；2. 掌握醇脫氫酶活力的測定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理以酵母為原料，利用熱變性、有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)等方法，提取具有一定純度的酵母醇脫氫酶。在提純過程中，每經(jīng)一步提純處理，都需測定酶蛋白質(zhì)含量和活力，并計(jì)算得比活力(本實(shí)驗(yàn)中比活力=活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì))。唯有比活力提高了，才證明所用提純措施有效，酶制劑的純度提高了。醇脫氫酶的輔酶NAD（以NAD為輔酶的醇脫氫酶，它只作用于一級(jí)醇、二級(jí)醇和半縮醛脫氫酶，動(dòng)物醇脫氫酶還能催化環(huán)一級(jí)醇脫氫，酵母醇脫氫酶無此活力。另有以NADP為輔酶的醇脫氫酶，它只作用于一級(jí)醇。），它能催化乙醇脫氫變成乙醛，脫下的氫則使NAD+還原。CH3CH2OH+NAD+

3、CH3CHO+NADH+H+當(dāng)有過量的醇存在時(shí)，NAD+ 被還原的速度與酶活力成正比，酶活力愈高，單位時(shí)間產(chǎn)生的NADH愈多。NADH對(duì)340nm紫外線有較強(qiáng)吸收，NAD+ 無此能力，因此可用測定A340nm的方法測得反應(yīng)體系中NADH含量，從而得知酶活力的大小。0本實(shí)驗(yàn)用Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)儀器：（1）干酵母粉：將鮮酵母分散成小塊，放在搪瓷盤吹干。干燥后，研磨成粉末。（2）燒杯（3）吸管0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml（4）容量瓶（5）試管（6）量筒（7）水浴鍋（8）臺(tái)天平（9）電子天平（10）離心機(jī)（5000r/min）（11）72

4、2型分光光度計(jì)（12）UV-900型紫外可見分光光度計(jì)2實(shí)驗(yàn)試劑：（1）3mol/L 乙醇溶液：量取無水乙醇（比重：0.789，相對(duì)分子質(zhì)量：46.07）174.6ml，加蒸餾水稀釋至1000ml。（2）0.06mol/L 焦磷酸鈉溶液（pH8.5）：稱取焦磷酸鈉（Na4P2O210 H2O）22.56g，溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。（3）0.0015mol/L NAD溶液：稱取NAD 0.0995g（NAD相對(duì)分子質(zhì)量：663.44）溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。（4）0.01mol/L 磷酸氫二鉀溶液：溶1.74g K2HPO4于蒸餾水并稀釋至1000ml。（5） 丙酮（A.R.）（

5、6） 0.066mol/L 磷酸氫二鈉溶液：溶9.37g Na2HPO4于蒸餾水并稀釋至1000ml。四、實(shí)驗(yàn)操作步驟 1酵母醇脫氫酶的提純（1）粗提置20g干酵母于250ml燒杯中，加0.066mol/L Na2HPO4溶液80ml，37水浴鍋保溫2h，不斷攪拌、再于室溫提取3h，離心20min（4000r/min）取上清液3ml，測定蛋白質(zhì)含量及酶活力，其余上清液量得體積后，傾于150ml燒杯中。（2） 熱變性沉淀雜蛋白將上清液55保溫1520min，不斷慢速攪拌。保溫畢，立即置冷水中冷卻，離心20min（4，4000r/min）。吸取上清液3ml，測蛋白質(zhì)含量及酶活力。其余上清液量得體積

6、后，傾于燒杯中。（3） 有機(jī)溶劑沉淀雜蛋白將上清液置鹽冰浴中降溫至-2以下，按100ml上清液加50ml丙酮的比例加入預(yù)先冷至-2以下的丙酮，邊加邊攪。加畢，放置片刻，低溫離心20min（0，4000r/min）。吸取上清液3ml，測蛋白質(zhì)含量及酶活力。其余上清液量得體積后，傾入已置于鹽冰浴的燒杯中。（4） 有機(jī)溶劑沉淀酶蛋白按100ml上清液加55ml丙酮的比例，逐滴加入冰冷的丙酮，使溶液保持-2以下。待沉淀完全后，低溫離心15min（0，4000r/min）。棄去上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，對(duì)冷水透析3h（在冰箱中進(jìn)行）。離心除去沉淀，上清液即為達(dá)到一定純度的醇脫氫酶制劑。

7、2.蛋白質(zhì)濃度的測定吸取1、2、3步驟所取的樣液及最后制得的酶制劑0.5ml，用蒸餾水稀釋100200倍。按考馬斯亮藍(lán)法或紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量。3.酶活力測定樣液及酶制劑均需用0.01mol/L K2HPO4溶液稀釋，稀釋倍數(shù)如下：V1（粗提取液）：V（Na2HPO4）=1：4（或1：9）V2（熱變性去雜蛋白樣液）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19）V3（有機(jī)溶劑去雜蛋白樣液）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19）V（酶制劑）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19）吸取0.06mol/L 焦磷酸鈉溶液0.5ml、3mol/L乙醇溶液0.1ml、0.0015mol/L NA

8、D溶液0.1ml、蒸餾水2.2ml置于石英比色杯中（容量4ml），加入已稀釋的樣液或酶制劑0.1ml，立即混勻，測定A340nm，以后每隔15s測1次，直至A340nm不變，記下反應(yīng)時(shí)間和A340nm讀數(shù)。于另一石英杯中，以蒸餾水代替底物，作空白試驗(yàn)。每分鐘A340nm增加0.001為1活力單位。表17 測酶活力加樣表（ml）比色杯焦磷酸鈉乙醇NAD蒸餾水稀釋后酶液空白杯0.500.12.30.1測試杯0.50.10.12.20.1表18 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄分析表提取步驟總體積/mlA蛋白質(zhì)濃度/(mg/ml)B蛋白質(zhì)總量/mgC酶活力/UD總活力/UE比活力/(Umg-1)F回收率（%）蛋白質(zhì)G酶

9、活力H1粗提1002熱變性去除雜蛋白3有機(jī)溶劑去除雜蛋白4有機(jī)溶劑沉淀雜蛋白注：C=AB，E=AD，F(xiàn)=D/B回收率=（每次總活力/第一次總活力）100% 純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力4.結(jié)果將測得數(shù)據(jù)或計(jì)算結(jié)果填入上表。提純酶時(shí)，常用此表，它反映了所采用的每一提純步驟的效果。（二）酵母醇脫氫酶的專一性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解酵母醇脫氫酶的專一性二、實(shí)驗(yàn)原理用不同的醇（乙醇、正丙醇、甲醇）作底物，觀察醇脫氫酶的專一性。RCH2OH+NAD+RCHO+NADH+H+根據(jù)NADH對(duì)340nm波長紫外線有最大吸收的特性，可用A340表示酶活力。每毫克酶蛋白有多少酶活力單位稱為比活力。醇脫氫酶對(duì)于各種

10、不同的醇應(yīng)有不同的比活力。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)儀器：（1）吸管0.1ml、0.5ml、1ml（2）試管（3）722型分光光度計(jì)（4）UV-900型紫外可見分光光度計(jì)2實(shí)驗(yàn)試劑：（1）3mol/L 甲醇溶液：120ml無水甲醇（比重：0.786，相對(duì)分子質(zhì)量：32）加蒸餾水稀釋至1000ml（2）3mol/L 乙醇溶液：174.6ml無水乙醇（比重：0.789，相對(duì)分子質(zhì)量：46.07）加蒸餾水稀釋至1000ml（3）3mol/L 正丙醇溶液：225ml正丙醇（比重：0.804，相對(duì)分子質(zhì)量：60.0）加蒸餾水稀釋至1000ml（4）0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液：溶解1.74gK2

11、HPO4于蒸餾水并稀釋至1000ml（5）0.06mol/L焦磷酸鈉溶液（pH8.5）：稱取焦磷酸鈉（Na4P2O210H2O）22.56g，溶于蒸餾水，稀釋至1000ml（6）0.0015mol/L NAD溶液：稱取NAD0.0995g（NAD相對(duì)分子質(zhì)量：663.44）溶于蒸餾水并稀釋至1000ml（7） 酵母醇脫氫酶液：將酵母醇脫氫酶的提純實(shí)驗(yàn)制得的酶制劑，用0.01mol/L磷酸氫二鉀溶液稀釋至每毫升含2001000活力單位。（8） Folin-酚試劑四、實(shí)驗(yàn)操作步驟1. 將4只石英比色杯（光徑1cm）編以0、1、2、3號(hào)，按下表加入試劑。先向0號(hào)比色杯加入0.1ml稀釋酶液，混勻，放

12、入分光光度計(jì)，用以調(diào)零。再向1號(hào)比色杯，加入0.1ml酶液（開始計(jì)時(shí)），迅速混勻測A340nm，以后每隔15s測一次A340nm，直至A340nm值不再上升。管號(hào)試劑01230.06mol/LNa4P2O2溶液（pH8.5）0.50.50.50.50.0015mol/L NAD溶液0.10.10.10.13mol/L 甲醇溶液0.13mol/L 乙醇溶液0.13mol/L 正丙醇溶液0.1H2O2.32.22.22.2表19 酵母醇脫氫酶的專一性測定加樣表按同法再測2、3號(hào)比色杯內(nèi)的溶液。以A340nm為縱坐標(biāo)，時(shí)間（s）為橫坐標(biāo)作圖。取初速度（曲線上升部分）求得酶活力。本實(shí)驗(yàn)以A340nm每

13、改變0.001單位定義為一個(gè)活力單位，以酶活力單位/分表示酶活力。2取酶液0.1ml，加蒸餾水4.9ml，搖勻。按（三）紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量。（以蒸餾水代替酶液作空白試驗(yàn)，以此調(diào)零）。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得蛋白質(zhì)濃度。計(jì)算得酵母醇脫氫酶對(duì)三種醇的比活力（比活力=活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì)）。以比活力為縱坐標(biāo)，醇的碳鏈長度為橫坐標(biāo)作圖，按圖說明酶的專一性。（三）紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量 蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利

14、用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。 紫外吸收法簡便、靈敏、快速、不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。 此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可

15、以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。 此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。 下面介紹四種紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法： 因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 測定時(shí)，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空

16、白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。 許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A11cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A11cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。文獻(xiàn)值A(chǔ)11cm,稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。 蛋白質(zhì)濃度 = (A28010 )/ A11cm,280nm (mg/ml) （因?yàn)?1%濃度10

17、mg/ml）例：牛血清清蛋白 ： A11cm=6.3 (280nm) 溶菌酶 ： A11cm=22.8 (280nm) 若查不到待測蛋白質(zhì)的A11cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取6支試管，按表24編號(hào)并加入試劑：表24 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定加樣表管號(hào)123456BSA（1.0mg/ml）01.02.03.04.0 5.0H2O5.0 4.0 3.02.01.0 0A280 用第1管為空白對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測定

18、吸光度A280，以A280為縱坐標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線。表25 樣液蛋白質(zhì)濃度測定加樣表管號(hào)123456樣液01.01.01.01.0 1.0H2O5.0 4.0 4.04.04.04.0A280利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（或含量），也可以用2至6管A280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的A11cm,280nm。 （四）酵母醇脫氫酶的凝膠層析一、目的學(xué)習(xí)用凝膠層析技術(shù)純化酶，并為動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)提供一定量的酵母醇脫氫酶。二、原理本實(shí)驗(yàn)用SephadexG-100純化酵母醇脫氫酶。三、實(shí)驗(yàn)器材1.層析柱1cm*90cm。2.恒流泵。3.紫外檢測儀。4.部分收集器。5.記錄儀。6.試管等普通玻璃器皿。四、實(shí)驗(yàn)試劑1.酶樣品：實(shí)驗(yàn)10