皮膚變態(tài)反應試驗操規(guī)

1、五、皮膚變態(tài)反應試驗操規(guī)目的確定重復接觸化妝品及其原料對哺乳動物是否可引起變態(tài)反應及其程度。 范圍本操規(guī)用于動物皮膚變態(tài)反應試驗的基本方法。 本操規(guī)適用于化妝品原料及其產(chǎn)品安全性毒理學檢測。1 依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部化妝品衛(wèi)生規(guī)范第二部分第6章：皮膚變態(tài)反應試驗中華人民共和國國家標準GB/T16886.10-2005醫(yī)療器械生物學評價第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗。2 設(shè)備與耗材2,4-二硝基氯代苯，肉桂醛，2-巰基苯并噻唑或?qū)Π被剿嵋阴?，弗氏完全佐劑、無菌水、80%乙醇、丙酮、刮毛器、脫毛膏、EP管外科手套、口罩、手術(shù)服、不同規(guī)格無菌注射器、一次性無菌紗布等。3 受試動物3.1 來

2、源：西安交通大學實驗動物中心3.2 動物種類：白化豚鼠20只：300500 g，23月齡，雌雄兼半，雌鼠無孕。3.3 飼養(yǎng)條件：全價營養(yǎng)顆粒飼料喂食，自由采食，自由飲水，室溫21±2，相對濕度4070%。4試驗步驟4.1材料制備受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應的最高濃度。水溶性受試物可用水或用無刺激性表面活性劑作為賦形劑，其它受試物可用 80%乙醇 （誘導接觸）或丙酮（激發(fā)接觸）作賦形劑。4.2試驗方法4.2.1 試驗準備a.取白化豚鼠20只，隨機分成2組，對照組（10只），試驗組(10只）、。適應環(huán)境一周后，正式試驗前一天，每只豚鼠背前區(qū)備皮4cm×6cm。b. 無論在誘

3、導階段或激發(fā)階段均應對動物進行全面觀察包括全身反應和局部反應，并作完整記錄。 c.試驗方法可靠性的檢查：實驗開始前選兩只備用豚鼠，使用4.2.1的局部誘導階段方法進行預實驗確定實驗的可行性。4.2.1 試驗過程（1）試驗前約 24h，將豚鼠背部左側(cè)去毛，去毛范圍為 4cm26cm2。 （2）局部誘導階段對去毛區(qū)域采用75%酒精消毒，覆蓋5層約8cm2的滴加適量樣品浸提液的擦鏡紙，使其貼敷在肩胛骨內(nèi)側(cè)皮膚上，再依次覆蓋3*3cm大小的塑料薄膜、紗布，再用醫(yī)用無刺激膠帶固定使其不脫落封閉固定 6h。觀察記錄敷貼后動物異常情況，第 7d 和第 14d 以同樣方法重復一次。(對照組按照同樣方法進行)(

4、3 )激發(fā)階段末次誘導后 14d28d， 將約 0.2mL 的受試物涂于豚鼠背部右側(cè) 2cm×2cm去毛區(qū)（接觸前 24h 脫毛） ，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再以無刺激膠布固定 6h。(對照組按照同樣方法進行)（4）動物觀察激發(fā)接觸后 24h和 48h 觀察皮膚反應，按照表1給出的分級標準對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行描述和分級，將觀察結(jié)果填寫至表2. 表1變態(tài)反應實驗皮膚反應評級皮膚反應積分紅斑和焦痂形成無紅斑0輕微紅斑（勉強可見）1明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2中度重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫（勉強可見）1中度水腫

5、（皮膚隆起輪廓清楚）2重度水腫（皮膚隆起1mm或超過1mm）3最高積分7表2試驗結(jié)果組別動物號碼時間24h48h試驗組12345678910對照組111213141516171819205結(jié)果判定當受試物組動物出現(xiàn)皮膚反應積分2 時，判為該動物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應陽性，按表 3 判定受試物的致敏強度。按表 3 判定受試物的致敏強度。如激發(fā)接觸所得結(jié)果仍不能確定，應于第一次激發(fā)后一周，給予第二次激發(fā)，對照組作同步處理表3致敏強度致敏率（%）致敏強度08弱928輕2964中6580強81100極強注：當致敏率為0時，可判斷為未見皮膚變態(tài)反應6.豚鼠最大值試驗6.1采用完全福氏佐劑（FCA）皮內(nèi)注射方法

6、檢測致敏的可能性。6.2實驗方法6.2.1 試驗過程（1）動物數(shù)試驗組至少用10只，對照組至少5只。如果試驗結(jié)果難以確定受試物的致敏性，應增加動物數(shù)，試驗組20只，對照組10只。（2）劑量水平誘導接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應的最高濃度， 激發(fā)接觸受試物濃度為不能（3）皮內(nèi)誘導階段按下圖所示（A、B、C），在每只動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)從頭向尾成對皮內(nèi)注射0.1mL，共注射6個點。 三個對稱點， 每點皮內(nèi)注射0.1mL下述溶液。 試驗組： A點 1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水的混合物。 B點 耐受濃度的受試物。 C點 用1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水配制的受試物，濃度與第2點相

7、同。 對照組：注射部位同實驗組。 A點 1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水的混合物。 B點 未稀釋的溶劑。 C點 用1：1（v/v）FCA/水或生理鹽水配制的濃度為 50%（w/v）的溶劑。 （4）局部誘導階段將涂有0.5g（mL）受試物的2cm×4cm濾紙敷貼在上述再次去毛的注射部位，然后用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定48h。對照組僅用溶劑作誘導處理。（5）激發(fā)階段將豚鼠軀干部去毛，用涂有0.5g（mL）受試物的2cm×2cm濾紙片敷貼在去毛區(qū)，然后再用兩層紗布，一層玻璃紙覆蓋，無刺激膠布封閉固定24h。對照組動物作同樣處理。如激發(fā)接觸所得結(jié)果不能確定，

8、可在第一次激發(fā)接觸一周后進行第二次激發(fā)接觸。對照組作同步處理。（6）動物觀察激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應，按照表1給出的分級標準對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行描述和分級，將觀察結(jié)果填寫至表4, 當試驗組動物皮膚反應積分1時，應判為變態(tài)反應陽性。應判為變態(tài)反應陽性，按表3對受試物進行致敏強度分級。表1變態(tài)反應實驗皮膚反應評級皮膚反應積分紅斑和焦痂形成無紅斑0輕微紅斑（勉強可見）1明顯紅斑（散在或小塊紅斑）2中度重度紅斑3嚴重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成4水腫形成無水腫0輕微水腫（勉強可見）1中度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）2重度水腫（皮膚隆起1mm或超過1mm）3最高積分7