細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1 簡(jiǎn)述1.1 本規(guī)范適用于中國(guó)藥典2005年版附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法一凝膠法和光度測(cè)定法。后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。1.2 供試品細(xì)菌毒素限值的確定。（一）藥典中有規(guī)定的，按供試品各論中規(guī)定限值；（二）尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的，按以下公式確定供試品內(nèi)毒素限值：L=K/M式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/kg/h表示。其中注射劑，K=5EU/kg/h；放射性藥品注射劑，

2、K=2.5EU/kg/h；鞘內(nèi)用注射劑，K=0.2EU/kg/h。M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。藥品人用最大劑量可參閱國(guó)家批準(zhǔn)的藥品說(shuō)明書(shū)和臨床用藥須知等權(quán)威著作，中國(guó)人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間小于1小時(shí)的按1小時(shí)計(jì)。按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說(shuō)明理由。1.3 供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MV D）按下式計(jì)算：MV D=C?L/L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；C為供試品溶液的濃度。當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C等于1.0ml/ml；當(dāng)L的單位以EU/mg或

3、EU/U表示時(shí)，C為供試品制備成溶液后的濃度，單位為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MV D取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度C: /L。在凝膠法中為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，在光度測(cè)定法中為所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低內(nèi)毒素濃度。1.4 在使用新一批號(hào)的鱟試劑前，必須進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。1.5 藥典中已有規(guī)定的品種或有其他內(nèi)毒素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的品種，可直接進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，如在檢驗(yàn)中出現(xiàn)干擾的情況需再進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；其他未建立內(nèi)毒素檢查的品種需先進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，確定不干擾濃度后再進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。1.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查過(guò)程中的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和供試品對(duì)照必須同時(shí)進(jìn)行，否則實(shí)

4、驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。2 實(shí)驗(yàn)材料及用具2.1 天平  供試品稱量用，精度為0.1mg以下。2.2 電熱干燥箱  除外源性內(nèi)毒素用，溫度應(yīng)能達(dá)到250。2.3 恒溫水浴箱或適宜的恒溫器（37±1）。2.4 水銀溫度計(jì)或酒精度計(jì)，精度在1以下。2.5 旋渦混合器。2.6 鱟試劑，應(yīng)具有國(guó)家主管部門(mén)的批準(zhǔn)文號(hào)。2.7 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，除另有規(guī)定外，應(yīng)使用由中國(guó)藥典生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標(biāo)準(zhǔn)品。2.8 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。光度測(cè)定用的檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。2.9

5、實(shí)驗(yàn)用具  移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無(wú)熱原吸頭）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、試管試管架、洗耳球、時(shí)鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。所用玻璃器皿須經(jīng)250干烤至少1小時(shí)。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾的器械。2.10 細(xì)菌內(nèi)毒素光度測(cè)定儀器3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備3.1 玻璃器皿的洗滌  竟玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來(lái)水竟殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。3.2 除

6、去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素  玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250，待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開(kāi)始計(jì)時(shí)，干烤至少1小時(shí)。達(dá)到規(guī)定時(shí)間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開(kāi)包裝的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開(kāi)包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。4 凝膠法操作方法4.1鱟試劑靈敏度復(fù)核鱟試劑靈敏度復(fù)核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否正確，也是考察檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。因此要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在使用一批新的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。4.1.

7、1 實(shí)驗(yàn)操作4.1.1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)，開(kāi)啟過(guò)程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進(jìn)行稀釋，制備成4個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2.0、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘（詳細(xì)過(guò)程參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書(shū)）。若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，可按其使用說(shuō)明書(shū)中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝、保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒

8、素工作品，為一次性使用。4.1.1.2 待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備取0.1ml/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時(shí)，取若干支按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混合在一起，然后每0.1 ml分裝到10mm×75mm凝集管中，要求至少分裝18管備用。4.1.1.3 加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列

9、每支分別加入0.1ml的2、0.5和0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水。4.1.1.4 加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37±1水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫60±2分鐘。4.1.1.5 觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動(dòng)，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）。4.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如最大濃度2.04管均為陽(yáng)性，最低濃度0.254管均為陰性，陰性

10、對(duì)照為陰性時(shí)實(shí)驗(yàn)為有效，按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（C）。C=lg-1(X/4)式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。4.1.3 結(jié)果判斷當(dāng)C在0.5-2（包括0.5和2）時(shí)判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以（標(biāo)示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。4.1.4 舉例設(shè)待復(fù)核鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：內(nèi)毒素濃度  （EU/ml）  0.25   0.125  0.0625  0.0

11、31  Nc     反應(yīng)終點(diǎn)濃度X重          1復(fù)          2         管          3數(shù)      

12、    4                                           0.125        

13、0;                   0.25                              0.0625     

14、60;                       0.0625C=lg-1(X/4)=lg-1（lg0.125lg0.25lg0.0625lg0.0625）/4       =0.105（EU/ml）在0.5-2范圍內(nèi)，符合規(guī)定。并且使用該批鱟試劑時(shí)，其靈敏度為標(biāo)示靈敏度0.105（EU/ml）。4.2 干擾實(shí)驗(yàn)4.2.1 操作方法干擾

15、試驗(yàn)的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。并且驗(yàn)證當(dāng)供試品的配方和工藝有變化，鱟試劑來(lái)源改變或供試品陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果呈陰性時(shí)供試品是否存在干擾作用。由于干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無(wú)關(guān)，因此在干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對(duì)干擾實(shí)驗(yàn)造成的陽(yáng)性影響。4.2.2 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的是初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表

16、示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。4.2.2.1 將無(wú)可檢測(cè)到內(nèi)毒素的供試品進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MV D=CL/0.03（0.03EU/ml為現(xiàn)今我國(guó)市售鱟試劑的最高靈敏度）。4.2.2.2 使用鱟試劑對(duì)每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照（即用該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度）。另取2支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照，2支加入2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。供試品陽(yáng)性對(duì)照制備舉例：制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽(yáng)性對(duì)照液方法，取0.3ml濃度為4EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液0.3m

17、l的稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液    制得0.6ml含2EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的稀釋倍數(shù)為4的供試品稀釋液。保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。4.2.2.3 當(dāng)陰性對(duì)照為陰性，陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，實(shí)驗(yàn)為有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照2管為陽(yáng)性時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)系列濃度中所有濃度的供試品管都不為陰性，或供試品陽(yáng)性對(duì)照不為陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明供試品對(duì)內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)存在干擾，則應(yīng)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋（不得超過(guò)MV D=CL/0.03），或通過(guò)氣

18、壓適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。當(dāng)供試品的內(nèi)毒素限值單位為EU/mg或EU/U活性單位時(shí)，應(yīng)將最小不干擾稀釋倍數(shù)換算成最大不干擾濃度（即該稀釋倍數(shù)下溶液的濃度），以mg/ml或活性單位/ml表示。4.2.2.4 舉例例：設(shè)某注射液限值為2.5EU/ml，按MV D=CL/計(jì)算出靈敏度為0.03EU/ml下的MV D為80倍，將供試品溶液稀釋一系列檢驗(yàn)，用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如下稀釋倍數(shù)原液510204080供試品溶液供試品陽(yáng)性對(duì)照如上結(jié)果可初步確定該樣品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。4.2.3 正式干擾實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

19、是檢驗(yàn)在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無(wú)干擾作用。使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。4.2.3.1 制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.0、0.5、0.25，（方法同4.1.1.1）。4.2.3.2 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液4.2.3.2.1 將供試品稀釋至預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將4.2.3.1中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個(gè)濃度即2.0、1.0、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。以注射用頭孢哌酮鈉（1g/瓶為例：取10ml檢查用水溶解注射用頭孢

20、哌酮鈉即為100mg/ml，設(shè)需將其稀釋20倍（5mg/ml）后備用。（注：凍干品或無(wú)菌粉末用檢查用水溶解后體積有無(wú)變化，根據(jù)具體情況定）。取一支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，加入1m檢查用水溶解，然后取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3ml制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液；再取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3ml加上2.7ml的5mg/ml頭孢哌酮鈉溶液，即為含10倍內(nèi)毒素稀釋液的供試品溶液，取0.3ml含10倍內(nèi)毒素稀釋液的供試品加上2.7ml的5mg/ml頭孢哌酮鈉溶液，即為含100倍內(nèi)毒素稀釋液的供試品溶液。其余依次類推。4.2.3.2.2 簡(jiǎn)化法制備含內(nèi)毒素的供試品溶液：0.5ml濃度為1.0EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml濃

21、度為10mg/ml的供試品溶液    得到1ml的含0.5EU/ml內(nèi)毒素的濃度為5mg/ml的供試品液。同理分別用0.5ml濃度為0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備含0.25 EU/ml 、0.125 EU/ml 和0.0625m EU/ml 內(nèi)毒素的濃度為5g/ml的供試品系列溶液。（其體積的大小視情況而定）。4.2.3.3 鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使

22、內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時(shí)，按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，將復(fù)溶后的鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到10×75mm凝集管中，要求至少分裝36管備用。4.2.3.4 加樣將準(zhǔn)備好的鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對(duì)照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、

23、0.5、0.25的內(nèi)毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對(duì)照。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，兩同試管架放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。4.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如兩組最大濃度2.0均為陽(yáng)性，最低濃度0.25均為陰性，陰性對(duì)照4管均為陰性時(shí)，按下式計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均（Et）。ES=lg-1(XS/4)Et=lg-1(Xt/4)式中   

24、0;    XS ,Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。4.2.3 當(dāng)ES在0.5-2.0（包括0.5和2.0）時(shí)，且Et在0.5 ES52.0 ES（包括0.5 ES和2.0 ES）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾試驗(yàn)，可在該濃度下對(duì)此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。當(dāng)ES不在0.5-2.0（包括0.5和2.0）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實(shí)驗(yàn)。應(yīng)使用適宜的方法排除干擾，如對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋，是排除干擾因素的簡(jiǎn)單有效方法。建立新品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，每個(gè)廠家至少取三個(gè)批號(hào)（不包括亞批）的供試品，用兩個(gè)以上

25、鱟試劑生產(chǎn)廠家的鱟試劑進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。4.2.5 舉例設(shè)供試品為某注射液，預(yù)實(shí)驗(yàn)中初步確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑檢測(cè)供試品是否對(duì)內(nèi)毒素檢查存在干擾。內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.25  0.125 0.0625 0.03  Nc反應(yīng)終點(diǎn)濃度1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度234                            

26、60;                              0.06250.06250.06250.06251 含供試品的2 內(nèi)毒素溶液34                       

27、0;                                  0.1250.1250.1250.125ES=lg-1(XS/4) = lg-1(lg0.0625lg0.125lg0.0625lg0.0625)/4 =0.125（EU/ml）Et=lg-1(Xt/4)  = lg-1(lg0.125lg0.12

28、5lg0.125lg0.125)/4 =0.125 （EU/ml）Et在0.5 ES2.0 ES范圍內(nèi)，說(shuō)明該供試品進(jìn)行20倍稀釋后確已排除干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。4.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠限度試驗(yàn)在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)必須做2支陽(yáng)性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。4.3.1 操作方法4.3.1.1 供試品溶液的制備首先計(jì)算MV D=C?L/、L的意義同1.3。為所使用鱟試劑的標(biāo)示靈敏度。然后將供試品進(jìn)行稀釋，其稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MV D。4.3.1.2 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)

29、品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液。（方法同4.1.1.1）。4.3.1.3 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用待檢測(cè)的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備）。4.3.1.4 陰性對(duì)照液即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水4.3.1.5 鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用輪在瓶頸輕輕劃痕，75%棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解、輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)溶物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時(shí)，取若干支，按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液

30、混和在一起，然后每0.1ml分裝到10×75mm凝集管中，要求至少分裝8管備用。4.3.1.6 加樣  取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品溶液或其稀釋液（其稀釋液不得超過(guò)MV D）作為供試品管，2支加入0.1ml陽(yáng)性對(duì)照溶液作為陽(yáng)性對(duì)照管（PC），2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對(duì)照管，（NC），2支加入0.1ml供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管（PPC）。4.3.1.7 將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘。保溫和取放試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。4.3.2

31、結(jié)果判斷當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性、供試品陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性且陰性對(duì)照都為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)方為有效。若供試品管2管均為陰性，認(rèn)為該供試品符合規(guī)定；如供試品2管均為陽(yáng)性，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；如2管中1管為陽(yáng)性，1管為陰性，按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中如有1管為陽(yáng)性，即認(rèn)為不符合規(guī)定。若第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)供試品的稀釋倍數(shù)小于MV D而結(jié)果出現(xiàn)2管均為陽(yáng)性或2管中1管為陽(yáng)性時(shí)，按同樣方法復(fù)試，復(fù)試時(shí)要求將其稀釋至MV D。4.3.3 舉例供試品為葡萄糖注射液，其內(nèi)毒素限值為0.5EU/ml，設(shè)所用鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml，MV D=C?L/=0.5/0.125=4將樣品進(jìn)行4倍稀釋，并做4倍稀釋下的

32、供試品陽(yáng)性對(duì)照。供試品供試品陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照結(jié)果是否有效有效結(jié)果判斷該批葡萄糖注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定4.4 凝膠半定量實(shí)驗(yàn)半定量實(shí)驗(yàn)是使用凝膠法估測(cè)供試品中內(nèi)毒素含量的方法。系利用供試品系列與鱟試劑反應(yīng)的終點(diǎn)濃度計(jì)算出供試品中內(nèi)毒素的含量。4.4.1 操作方法4.4.1.1 供試品系列的制備用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開(kāi)始進(jìn)行對(duì)倍稀釋，制備成2、4、8等N個(gè)濃度，但最大稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MV D。N可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同確定。4.4.1.2 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.0、1、0.5、0.25，

33、（方法同4.1.1.1）。4.4.1.3 供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用已確定不干擾濃度或稀釋倍數(shù)的供試品溶液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備）。4.4.1.4 陰性對(duì)照液即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。4.4.1.5 鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支或分裝好的鱟試劑122N支，其他準(zhǔn)備按正式干擾實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的“鱟試劑準(zhǔn)備”。4.4.1.6 將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中10支（管）放在試管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對(duì)照。 

34、60;  將另外2N支（管）鱟試劑放在試管架上，排成N列，每列2支（管）。每列每支分別加入0.1ml一個(gè)濃度的供試品溶液。另2支（管）加入0.1ml供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液作為供試品的陽(yáng)性對(duì)照。4.4.1.7 將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘。保溫和取放試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。4.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列最大濃度2均為陽(yáng)性，最低濃度0.25均為陰性，陰性對(duì)照為陰性恭試品陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性時(shí)，按下式計(jì)算內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（t）和供試品系列溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（

35、CE）。t=lg-1(Xt/2)CE=lg-1(X/2)式中    Xt為內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。            X為供試品溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg），反應(yīng)終點(diǎn)濃度為供試品溶液每一系列平行管的終點(diǎn)，稀釋倍數(shù)乘以標(biāo)志靈敏。4.4.3 結(jié)果判斷當(dāng)t在0.52之間，試驗(yàn)方為有效。供試品的內(nèi)毒素含量即為CE。如果實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如果試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)

36、毒素濃度小于（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的供試品，則記錄為小于×該供試品的最小稀釋倍數(shù)）。如果結(jié)果都為陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。4.4.4 舉例設(shè)供試品為某注射液，干擾實(shí)驗(yàn)已確定其最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，其內(nèi)毒素限值為10EU/ml，現(xiàn)使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑檢測(cè)供試品中的內(nèi)毒素含量。MV D=C?L/=10/0.03320倍將供試品溶液先稀釋至20倍后，再進(jìn)行對(duì)倍稀釋。將20倍稀釋液稀釋2、4、8、16倍，同時(shí)制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列。內(nèi)毒素濃度（EU

37、/ml）0.0625 0.03 0.015 0.0075    Nc反應(yīng)終點(diǎn)濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液                                             

38、60;            0.06250.0625供試品稀釋倍數(shù)   1    2     4     8   16  PPC反應(yīng)終點(diǎn)稀釋倍數(shù)供試品系列                     

39、                84t=lg-1(Xt/2)         =lg-1 （lg0.0625lg0.0625）/2         =0.0625（EU/ml）CE=lg-1(X/2) =lg-1 lg（8×0.03）lg（4×0.03）/2 =0.170EU/ml供試品2

40、0倍稀釋液的內(nèi)毒素含量=0.170EU/ml由于供試品先被稀釋了20倍，因此供試品的內(nèi)毒素含量為0.170×20=3.40EU/ml，低于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，此批注射液內(nèi)毒素檢查項(xiàng)符合規(guī)定。5 光度測(cè)定法操作方法光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與被毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）之間存在著量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。&#

41、160;   顯色基質(zhì)法系列用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特殊底物顯色釋放出的有色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的有色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。5.1 儀器的設(shè)置濁度法分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法，顯色基質(zhì)法也分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。針對(duì)不同的方法，在配置相應(yīng)的測(cè)定儀器。在實(shí)驗(yàn)來(lái)勢(shì)前，應(yīng)根據(jù)儀器的說(shuō)明和實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)設(shè)定反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫

42、度（一般為37±1），檢測(cè)波長(zhǎng)等相關(guān)系數(shù)。供試品和鱟試劑的分裝加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，需參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。5.2.1 實(shí)驗(yàn)操作5.2.1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用檢查用水將一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），如10、1、0.1EU/ml或0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EU/ml，但最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。稀釋操作方法同凝膠法。5.2

43、.1.2 鱟試劑的準(zhǔn)備要求內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列中每一濃度至少做3支平行管，并要求同時(shí)做2支陰性對(duì)照。根據(jù)所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度的個(gè)數(shù)來(lái)計(jì)算所需要的鱟試劑體積。由于凝膠法鱟試劑和光度測(cè)定法鱟試劑在工藝上有所不同，因此在進(jìn)行光度法檢測(cè)時(shí)需使用專用鱟試劑而不能用凝膠法鱟試劑代替。光度法鱟試劑都為0.5ml以上裝量，在溶解后需將所有鱟試劑混合在一起，備用。5.2.1.3 加樣將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液和陰性對(duì)照按儀器要求的體積分裝到儀器配置的反應(yīng)容器中，如小試管或微孔板。再加入要求體積的鱟試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后將反應(yīng)容器放入光度測(cè)定儀中進(jìn)行反應(yīng)。5.2.2 結(jié)果判斷當(dāng)陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度

44、的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。否則須重新試驗(yàn)。5.3 干擾實(shí)驗(yàn)干擾實(shí)驗(yàn)的目的同凝膠法干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。5.3.1 實(shí)驗(yàn)操作5.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備操作同5.2.1.1。5.3.1.2 將供試品進(jìn)行一系列的稀釋，但不得超過(guò)MV D。選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一和靠近中點(diǎn)的一和內(nèi)毒素濃度，設(shè)為m，作為添加到供試品中的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度?？砂慈缦路椒ㄖ苽涔┰嚻访恳幌♂尡稊?shù)下的樣品陽(yáng)性對(duì)照：如使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線為50、5、0.5、0.05