[z]分子熒光法測定維生素B2的含量237

1、實驗項目】分子熒光法定量測定維生素的含量【實驗追求】1. 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析維生素的基本原理。2. 了解熒光分光光度計的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，掌握其基本制作?！?實驗原理 】熒光是光致發(fā)光。任何熒光物質(zhì)都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 , 發(fā)射波長總是大于激發(fā)波 長。熒光激發(fā)光譜是通過測定熒光體的發(fā)光通量隨波長變化而獲得的光譜，反映不同波長激發(fā) 光引起熒光的相對效率。 熒光發(fā)射光譜是當(dāng)熒光物質(zhì)在固定的激發(fā)光源照射后所產(chǎn)生的分子熒 光，是熒光強(qiáng)度對發(fā)射波長的關(guān)系曲線，表示在所發(fā)射的熒光中各種波長相對強(qiáng)度。由于各種 不同的熒光物質(zhì)有它們各自特定的熒光發(fā)射波長，可用它來鑒定熒光物質(zhì)。有些發(fā)熒光的物質(zhì) 其

2、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比，故可用熒光分光光度法測定其含量。維生素溶液在藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在附近。維生素在=的溶液中熒光強(qiáng) 度最大，而且其熒光強(qiáng)度與維生素溶液濃度呈線性關(guān)系，因此可以用熒光光譜法測維生素的含 量。維生素在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)光黃素，光黃素也是一 個能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素的熒光強(qiáng)得多，故測維生素的熒光時溶液要控制在酸性范 圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度有以下關(guān)系：=£當(dāng)實驗條件一定時，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系：【 儀器與試劑 】1. 儀器：熒光分光光度計（型號： ）。石英比色皿。容量

3、瓶2. 試劑：維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液（卩）（已加乙酸）【 實驗內(nèi)容與步驟 】. 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液的配制取維生素（卩）標(biāo)準(zhǔn)溶液、分別置于的容量瓶中，標(biāo)定，搖勻。取待測溶液于的容 量瓶中，標(biāo)定，搖勻。.激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制（用的標(biāo)準(zhǔn)溶液）設(shè)置入為發(fā)射波長，在范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射波長強(qiáng)度和激發(fā)波長的關(guān)系曲線，便得到激 發(fā)光譜。記錄最大激發(fā)波長設(shè)置入為最大激發(fā)波長即，在范圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長間的函數(shù)關(guān)系，便得 到熒光發(fā)射光譜從熒光發(fā)射光譜上找出其最大的發(fā)射波長 入和熒光強(qiáng)度。3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的熒光測定將激發(fā)波長固定在，熒光發(fā)射波長為，測量上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度，按濃度從

4、從低到高測定。在同樣條件下測定未知溶液的熒光強(qiáng)度，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未知試樣中維生素的濃度。【實驗數(shù)據(jù)】.激發(fā)波長入熒光發(fā)射波長入.標(biāo)準(zhǔn)溶液劑待測溶液的濃度和熒光強(qiáng)度記錄維生素溶液濃度（卩）待測溶液相對熒光強(qiáng)度-可得待測溶液的濃度為卩.【實驗圖像】.以入為發(fā)射波長，溶液濃度為 卩，在范圍掃描得到的熒光強(qiáng)度和激發(fā)波長的關(guān)系曲線3. 設(shè)置激發(fā)波長為，溶液濃度為卩，在范圍內(nèi)掃描，所得發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長間的熒光發(fā)射光譜如下：hi班厠K-Kk附 nrr|He種口刑14OQ0曲Uiir2521.D9X1(1.以激發(fā)波長入熒光發(fā)射波長入，測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫

5、坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：F命加3啣幽NoA0Al0.00It01御K0.S®tone WADi41007l.Offi1DM5OOQ£WQfflOQ則0.1X7107D.7S4W她0.0052ion109&sidHoL an.ara n?e.5011o 蕩引75奧口1曲13D-704 磅 5d1EDI 詬曲*r 曲51!廠 Ewpli:祕 |jSoandeird 'alinralnnn.x«r?ntwci h.QWEI：而廠a，|5EL.Q wB|5.Q! m刼：38D.觀【結(jié)果分析與討論】.石英皿是四面透光的，拿的時候不能接觸到四個透光面，只能拿上

6、下角部，擦外壁殘留液時 由于擦鏡紙不吸水，故可先用吸水紙巾擦干，再用擦鏡紙擦。.本次實驗所得到的值為，而理論值為，相關(guān)度很接近，說明準(zhǔn)確度比較高，溶液配制比較準(zhǔn) 確。.配制好的溶液應(yīng)盡快測量，避免久置成分變化而影響結(jié)果。.干擾熒光分光分光度法的因素：()溶劑：同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)。溶劑的極性增強(qiáng)，對激發(fā) 態(tài)會產(chǎn)生更大的穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長紅移，熒光強(qiáng)度增大。()溫度：升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效率降低。():大多數(shù)含有酸性或堿性取代基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受的影響很大。()溶液表面活性劑的存在，減少非輻射躍遷的概率，提高了熒光效率。()溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的順磁性質(zhì)，使激發(fā)單重態(tài)分子向三重態(tài)的體系間竄躍速 率加大，因而會使熒光效率降低?！舅伎碱}】CTGS-資料文件、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：原因是由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測十分微弱光信號的能力，并且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成 正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度也可以增大熒光強(qiáng)度，使測定的靈敏度提高。而吸收光度法測定的是吸 光度，不管是增大入射光強(qiáng)度，還是提高檢測器的靈敏度，都會使透射光信號與入射光信號以 同樣的比例增大，吸光度值不會改