抗(抑)菌試驗(yàn)

1、抗(抑)菌試驗(yàn)2.1.8.1 目的 測(cè)定抗(抑)菌產(chǎn)品對(duì)細(xì)菌和真菌的抗(抑)菌作用。 常使用的方法有抑菌環(huán)試驗(yàn)、 最小抑制濃度測(cè)定試驗(yàn)、 滯 留 抑 菌 效 果 測(cè) 定 試 驗(yàn) 、洗衣粉抗菌效果測(cè)定試驗(yàn)、振蕩燒瓶試驗(yàn)、浸漬試驗(yàn)與奎因試驗(yàn)，可視 情況選用。2.1.8.2 抑菌環(huán)試驗(yàn)2.1.8.2.1 原理利用抑菌劑不斷溶解經(jīng)瓊脂擴(kuò)散形成不同濃度梯度， 以顯示其抑菌作用。 試驗(yàn)通 過抑菌環(huán)大小以判斷其是否具有抑菌能力。 本試驗(yàn)適用于抑菌劑與溶出性抗 (抑) 菌產(chǎn)品的鑒定。2.1.8.2.2 試驗(yàn)器材(1) 金黃色葡萄球菌 (ATCC 6538) 、大腸桿菌(8099) 、白色念珠菌 (ATCC 1

2、0231) 菌懸液(見 2.1.1.2) 及根據(jù)抑菌劑特定用途所用的其他菌懸液。(2) 抑菌劑載體 (5 mm 直徑園形新華一號(hào)定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌 處理后，置120C烤干2h,保存?zhèn)溆?。(3) 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所需器材 ( 見 2.1.1.3) 。 微量移液器(5卩l(xiāng)50卩l(xiāng)，可調(diào)式)。(5) 游標(biāo)卡尺。(6) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基與沙堡瓊脂培養(yǎng)基2.1.8.2.3 操作程序(1) 抑菌片的制備 : 對(duì)液體抑菌劑，取無菌并干燥的濾紙片。每片滴加實(shí)際使用濃度抑菌劑溶液20卩l(xiāng) ,然后將濾紙片平放于清潔的無菌平皿內(nèi)， 開蓋置 溫箱(37 C)中烤干，或置室溫下自然干燥后備用

3、。溶出性抗(抑)菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為5mm厚不超過4mm圓片(塊)， 每 4 片 ( 塊 ) 一組。(2) 陰性對(duì)照樣片的制備 : 取無菌干燥濾紙片，每片滴加無菌蒸餾水 20卩l(xiāng)，干燥后備用。溶出性抗(抑)菌產(chǎn)品的陰性對(duì)照樣本，應(yīng)取同種材質(zhì)不含抑菌成份的 樣品，制成與試驗(yàn)組大小相同的樣片 (塊)。(3) 試驗(yàn)菌的接種：用無菌棉拭子蘸取濃度為 5X 105cfu/ml5X 106cfu/ml試驗(yàn)菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹 3次。每涂抹1 次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 60°，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫 干燥 5min 。(4) 抑菌劑樣片貼放 ： 每次試驗(yàn)貼放

4、 1 個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放 4 片試 驗(yàn)樣片， 1 片陰性對(duì)照樣片，共 5 片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各 樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放好后，用無 菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37C溫箱，培養(yǎng)16h18h 觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑 ( 包括貼片 ) 并記錄。試驗(yàn)重復(fù) 3次。測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)， 應(yīng)選均勻而完全無菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行。 測(cè)量其直徑應(yīng) 以抑菌環(huán)外沿為界。2.1.8.2.4 評(píng)價(jià)規(guī)定(1) 抑菌作用的判斷 ： 抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者，判為有抑菌作用。抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者，判為無抑菌作用。(2) 3

5、 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。(3) 陰性對(duì)照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無效。2.1.8.2.5 注意事項(xiàng)(1) 每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照， 不可省略。 在報(bào)告中亦必須將對(duì)照組的 結(jié)果列出。(2) 接種用細(xì)菌懸液的濃度應(yīng)符合要求。 濃度過低， 接種菌量少， 抑菌環(huán) 常因之增大 ; 濃度過高，接種量過多，抑菌環(huán)則可減小。(3) 應(yīng)保持瓊脂濃度的準(zhǔn)確性，否則可影響抑菌環(huán)的大小。(4) 培養(yǎng)時(shí)間不得超過 18h 。培養(yǎng)過久， 部分細(xì)菌可恢復(fù)生長(zhǎng)， 抑菌環(huán)變 小。(5) 抑菌環(huán)直徑可受抑菌劑的量、抑菌性能和干濕度影響。故抑菌劑濾紙片應(yīng)在 試驗(yàn)當(dāng)天制備。2.1.8.3 最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)(

6、瓊脂稀釋法)2.1.8.3.1 原理本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的抑菌劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中， 然后點(diǎn)種細(xì)菌，通過細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抗(抑)菌物質(zhì)抑制受試菌生長(zhǎng)的最 低濃度，即最小抑菌濃度(Mi ni mal In hibitory Co nee ntratio n, MIC)。本方法適用于不溶性抗(抑)菌產(chǎn)品。2.1.8.3.2 試驗(yàn)器材(1) 菌株金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099 或 ATCC 11229。 可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。(2) 水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH ,稱取38gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中， 加熱至沸騰溶解，然后121C高

7、壓滅菌15min,置45C50C水浴備用，此培養(yǎng) 基將用于對(duì)照試驗(yàn)。( 3) 0.03mol/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.2。(4) 加樣器(1卩l(xiāng)10卩l(xiāng) )。(5) 45C50 C水浴恒溫箱。( 6)吸管、試管、平皿。(7) 37 C培養(yǎng)箱。2.1.8.3.3 操作步驟(1) 抗(抑)菌溶液的配制：以無菌操作取 5ml或5g (固體研磨后)樣品，放 入 45ml 滅菌磷酸緩沖液中， 充分震蕩溶解， 配成 10%的均勻分散的溶液或懸液。(2) 含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將已配成 10%勺抗(抑)菌溶液或懸液用 PBS做對(duì) 倍系列稀釋成不同濃度的受試液，置 45C50C水浴恒溫備用。(3) 雙倍濃度培

8、養(yǎng)基配制：稱取76gMH瓊脂培養(yǎng)基，溶于1000ml水中。加熱至 沸騰溶解。然后121C壓力蒸汽滅菌15min，置45C50C水浴備用。此培養(yǎng)基 將用于稀釋抗(抑)菌溶液或懸液。(4) 含抗(抑)菌液培養(yǎng)基的配制：分別取10ml系列稀釋的抗菌液加入平皿內(nèi)。 將在45C50C水浴中的雙倍MH瓊脂培養(yǎng)基10ml，加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃 平板，使抗(抑)菌液和培養(yǎng)基充分混勻，待凝固后備用。(5) 用加樣器取1卩l(xiāng)2卩l(xiāng) (含菌量約為107cfu/ml )菌懸液點(diǎn)種于含抗(抑) 菌液培養(yǎng)基的平皿，接種后所形成的菌液圈直徑約 5mm- 8mm(每個(gè)點(diǎn)菌量約為 104cfu )。(6) 以同樣方法接種不含

9、抗(抑)菌成分的MH瓊脂平板，作為陽性對(duì)照。(7) 將接種后的平板放置35C培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)18h24h，觀察結(jié)果。2.1.8.3.4 評(píng)判規(guī)定菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低抗(抑)菌液濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。2.1.8.3.5 注意事項(xiàng)( 1 )接種時(shí)，應(yīng)由低抗(抑)菌劑濃度向高濃度平板依次接種，最后接種對(duì)照 平板。(2) 為了保證平板受熱均勻，培養(yǎng)時(shí)平板堆放不得超過4個(gè)。2.1.8.4 最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)(營養(yǎng)肉湯稀釋法)2.1.8.4.1 原理本試驗(yàn)將不同濃度的抑菌劑混合溶解于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 然后接種細(xì)菌， 通過 細(xì)菌的生長(zhǎng)與否，確定抗(抑)菌劑抑制受試菌

10、生長(zhǎng)的最低濃度，即最小抑菌濃 度(Minimal Inhibitory Concentration ,MIC)。本方法式用于可溶性抑菌產(chǎn)品。2.1.8.4.2 試驗(yàn)器材(1)試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大腸桿菌 8099 或 ATCC 11229。 可根據(jù)抑菌劑的用途，選擇特定的菌株。( 2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，見附錄 A。( 3)稀釋液，見附錄 A。( 4)吸管、試管(5) 37 E培養(yǎng)箱。2.1.8.4.3 操作步驟( 1)按 2.1.1.2 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液( 2)含抗菌劑培養(yǎng)基配制：將抗(抑)菌溶液用蒸餾水做對(duì)倍系列稀釋成不同 濃度的受試液，取各稀釋度受試液 2.5ml 加入到含 2.5ml 雙倍濃度營養(yǎng)肉湯的試 管中。(3) 取 0.1ml 含菌量約為 108cfu/ml 菌懸液接種于含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯 的試管中，作為試驗(yàn)組樣本。(4) 以同樣方法接種不含抗(抑)菌劑的營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陽性對(duì)照組 樣本。(5) 取 2 支含營養(yǎng)肉湯的試管中，作為陰性對(duì)照組樣本。(6) 將試驗(yàn)組樣本、陽性對(duì)照組樣本及陰性對(duì)照組樣本放置37C培養(yǎng)箱中，培 養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。( 7)試驗(yàn)中應(yīng)將試驗(yàn)用菌懸液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，其作用濃度應(yīng)為565X 10 cfu/ml 5X 10