金銀花的組織培養(yǎng)

1、金銀花(Lonicera japonica Thunb.)的愈傷組織的誘導(dǎo)和分化劉連芬 錢關(guān)澤 (聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 聊城 252059)摘要 以金銀花的莖、葉片、芽為外植體,在70個不同濃度IAA、NAA、6-BA組合的MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo),分析了金銀花的快速繁殖體系的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)芽是金銀花組織培養(yǎng)的最佳外植體，IAA和NAA的最佳濃度均為1 mgL-1，6-BA的最適濃度為0.1 mgL-1，確定適宜的初代培養(yǎng)基為: MS+6-BA 0.1 mgL-1 +NAA 1 mgL-1，誘芽培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.1 mgL-1+NAA0.02 mgL-1.關(guān)鍵詞 愈傷

2、組織，金銀花, 快速繁殖，組織培養(yǎng) 金銀花(Lonicera japonica Thunb.)屬忍冬科忍冬屬植物，又名忍冬、銀花、雙花、二寶花。該種為多年生半常綠木質(zhì)藤本 王光全等. 金銀花生物學(xué)特性及其栽培利用J. 江蘇林業(yè)科技. 27(6) , 2000.，節(jié)間中空，節(jié)部膨大，不定根發(fā)達(dá)；單葉對生，葉片卵形或長卵形，兩面被柔毛；每葉腋內(nèi)由二花組成一小聚傘花序，花兩側(cè)對稱，花冠唇形，初開時為白色，2至3天后變成金黃色,故名金銀花 馬清溫,丁作超,孫震曉,萬鵬.山東藥用植物M.濟南:山東科學(xué)技術(shù)出版社. 1998.；漿果球形，藍(lán)黑色，成對生于葉腋中。花期46月，果期1011月 陳志遠(yuǎn). in:

3、 祁承經(jīng), 湯庚國. 樹木學(xué)（南方本）ed. 2, M. 北京: 中國林業(yè)出版社. 2005.。除西北、東北等高寒、干旱地區(qū)和海南外，全國各地均有分布。金銀花全草均可入藥，花蕾入藥稱為金銀花,莖藤為金銀藤或忍冬藤。二者功效相近,但忍冬藤的藥力較弱，其性味甘寒,有清熱解毒之功能，有用于治療水痘、毒菌中毒等癥的報道。金銀花功能清熱解毒、消炎、除火，主治溫病、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、肺炎、痢疾、痛腫潰瘍、丹毒等癥3。 金銀花花蕾含有揮發(fā)性芳香油、肌醇、皂甙、綠原酸和黃酮類化合物等，還含有肉桂酸、橙花醇、茉莉醛等；莖中含有生物堿；葉中含有忍冬素、忍冬甙和木犀素等。據(jù)藥理研究，金銀花對痢疾桿菌、大腸桿菌、葡

4、萄球菌、肺炎雙球菌等有抑制作用 趙國玲, 劉佳佳, 林丹, 章曉驊, 王暉. 金銀花化學(xué)成分及藥理研究進展J. 中成藥, 2002, 24(12):973976.。在2003年的 “非典”時期，以金銀花為重要成分的中草藥對“非典”的防治作用非常顯著。金銀花除作為用途廣泛的中藥材外，還具有良好的保健作用。金銀花茶香氣宜人，可以制作飲料，對防治盛夏中暑、上呼吸道感染、風(fēng)熱感冒和腸胃疾病有良好的效果。對清除人體自由基、延緩衰老、提高人體免疫機能等具有良好的作用，因而也是高血壓和心血管系統(tǒng)患者降低膽固醇的保健佳品。早期金銀花藥材均為取自野生材料，隨著需要量的加大，逐漸開始有人栽植，并分化出密銀花、東銀

5、花等地方類型。目前人們對金銀花的需求無論在數(shù)量和質(zhì)量上都急劇增長，實際生產(chǎn)能力還不能滿足需要。尤其是金銀花的品種較少，主要是引自野生的種源。運用現(xiàn)代生物技術(shù)進行新品種培育有望成為解決產(chǎn)量和質(zhì)量問題的有效手段。組織培養(yǎng)技術(shù)是植物脫毒和快速繁殖的有效手段，探索金銀花的組培技術(shù)有重要的經(jīng)濟意義。此前對鳳爪金銀花已有組培報道 王光全, 孟慶杰, 孟慶軍.鳳爪金銀花的組織培養(yǎng)技術(shù)J. 河北林業(yè)科技, 2002(5): 25.，但經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)金銀花與前者組培條件有所不同。我們分別采用莖、葉、芽作外植體，用不同的激素組合進行對照實驗，以探索金銀花的組培條件。1 材料與方法1.1 材料 從聊城大學(xué)校園采集四葉期

6、的健壯金銀花幼莖,剪取莖、葉片、芽作外植體進行培養(yǎng)。1.2 方法 培養(yǎng)基 試驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,以不同的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合共設(shè)計采用了七十種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1M70和九種不定芽增殖培養(yǎng)基M71M79(見表1) 。所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖,0.65%瓊脂，調(diào)至pH 5.8,分裝于100 ml錐形瓶內(nèi)，每瓶25 ml,封口后在1210C條件下滅菌20 min，并且將重蒸水、鑷子、解剖刀、解剖針、濾紙用聚丙烯薄膜包裝后一并滅菌。待培養(yǎng)基冷凝后，放入超凈工作臺，紫外線表面滅菌1小時，準(zhǔn)備接種。 表1 培養(yǎng)基的成分34TAB. 1 The composition of mediaMediu

7、mComposition of plant growth substances(mgL-1)M1-M7M8-M14M9-M21M22-M28M29-M35M36-42M43-M49M50-M56M57-M63M64-M70M71M72M73M74M75M76M77M78M79MS+IAA 0.12 + 6-BA 0.1MS+IAA 0.12 + 6-BA 0.5MS+IAA 0.12 + 6-BA 1.0MS+IAA 0.12 + 6-BA 1.5MS+IAA 0.12 + 6-BA 2.0MS+NAA 0.12 + 6-BA 0.1MS+NAA 0.12 + 6-BA 0.5MS+NAA 0

8、.12 + 6-BA 1.0 MS+NAA 0.12 + 6-BA 1.5 MS+NAA 0.12 + 6-BA 2.0MS+NAA 0.02 + 6-BA 0.1MS+NAA 0.02 + 6-BA 0.5MS+NAA 0.02 + 6-BA 1.0MS+NAA 0.05 + 6-BA 0.1MS+NAA 0.05 + 6-BA 0.5MS+NAA 0.05 + 6-BA 1.0MS+NAA 0.08 + 6-BA 0.1MS+NAA 0.08 + 6-BA 0.5MS+NAA 0.08 + 6-BA 1.0(注：0.12代表0.1,0.3,0.5,0.8,1,1.5,2(mgL-1) )

9、愈傷組織的誘導(dǎo) 取新鮮的莖,葉,芽,先用流水沖洗30分鐘,然后放到超凈工作臺上,紫外燈光照30 min,用70%酒精滅菌15 s,再用0.1%升汞滅菌5 min,無菌水沖洗3-5次,用無菌濾紙吸干材料表面的水分。用手術(shù)刀將材料切成若干小片，將材料接種在M1-M70培養(yǎng)基上,先經(jīng)暗培養(yǎng)24小時，然后置于25 0C和光照為1000-1500 lx (12 h/d)培養(yǎng)。 不定芽的誘導(dǎo) 將初代培養(yǎng)的愈傷組織在無菌條件下切割，轉(zhuǎn)接到誘芽培養(yǎng)基M71-M79上。置于25 0C下，先暗培養(yǎng)一天，然后置于光照為1000-1500 lx（12 h/d）條件下培養(yǎng)。2 結(jié)果與分析2.1外植體對誘導(dǎo)愈傷組織的影響

10、不同類型的外植體對誘導(dǎo)愈傷組織的效果不同（見表2） 表 2 外植體對誘導(dǎo)愈傷組織的影響 圖1 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率TAB. 2 Effects of different explants Fig. 1 Incucement rates of different explantsExplantsRate of mean callus (%)7d14d21d28dBuds30.170.290.599.6Leaves13.750.188.995.7Stems1.25.37.18.2試驗結(jié)果表明，用芽做外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，不僅愈傷組織數(shù)量多而且誘導(dǎo)速度快；用葉作外植體也誘導(dǎo)出了愈傷組織，但

11、速度比較慢，數(shù)量相對較少；實驗顯示，用莖作外植體誘導(dǎo)率低于用芽和葉，而且褐化現(xiàn)象較嚴(yán)重。王光全等報道以具芽的莖為外植體進行組織培養(yǎng)獲得成功，實際上是先誘導(dǎo)出叢生芽，再用芽進行組織培養(yǎng)。2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 不同濃度的生長素和細(xì)胞分裂素的組合對愈傷組織誘導(dǎo)的效果不同。 IAA和NAA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響試驗結(jié)果表明(表3,表4，圖2),NAA和IAA都是在0.5 mgL-11.5 mgL-1濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)效果較好.其中又以NAA濃度為1.0 mgL-1時效果最好,誘導(dǎo)率最高，達(dá)97.5%。隨著濃度升高誘導(dǎo)率下降；當(dāng)濃度低于0.5 mgL-1時,誘導(dǎo)效果也欠佳。IAA濃度為1.0 mgL-1

12、時誘導(dǎo)率也較高,達(dá)到88.3%。表3 NAA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響（6-BA濃度相同）TAB. 3 Effects of NAA in different concentrations onthe induction of calliMaterialConcentrationof NAA(mgL-1)Number ofinoculationInduction rate（%）20d25d30dExplants0.1200000.32012.513.321.2 0.520 4045.478.50.820 30.133.675.61.02063.267.997.51.520 57.865.690.

13、32.02031.235.760.3表4 IAA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響（6-BA濃度相同）TAB. 4 Effects of IAA in different concentrations onthe induction of calliMaterialConcentrationof IAA(mgL-1)Number ofinoculationInduction rate(%)20d25d30dExplants0.1200000.32010.211.518.9 0.520 3039.2710.820 2728.573.21.0205456.788.31.520 46.352.175.62.0

14、2025.427.753.2圖2 不同NAA濃度下芽愈傷組織誘導(dǎo)率Fig. 2 Effects of NAA concentrations on the inductionNAA濃度圖 3 不同IAA濃度下芽愈傷組織誘導(dǎo)率Fig.3 Effects of IAA concentrations on the inductionIAA濃度2.2.2 6-BA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 試驗結(jié)果表明（見表5）6-BA濃度在0.1 mgL-1和0.5 mgL-1時誘導(dǎo)效果較好。其中0.1 mgL-1誘導(dǎo)率達(dá)95.1%。表5 6-BA濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響(生長素濃度相同)TAB. 5 Effects

15、 of 6-BA in different concentrations onthe induction of calliMaterialConcentration of 6-BA(mgL-1)Induction rate（%）IAA（1 mgL-1）NAA（1 mgL-1）20d25d30d20d25d30dExplants0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 56.335.421.50.8076.341.230.31.1095.185.271.51.1081.842.1351.5090.957.945.62.5010010081.52.50圖 4 不同6-BA濃度下芽愈傷組織誘導(dǎo)率（IA

16、A和NAA分別為1 mgL-1時）Fig.4 Effects of IAA concentrations on the induction6-BA濃度表6 不同培養(yǎng)基上時間對誘導(dǎo)愈傷組織的影響 圖5 不同培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率的變化TAB. 6 Effects of different media and culture time Fig.5 Effects of media on the inductionMediumRate of mean calli(%)20d25d30dM3M5M6M10M12M13M38M40M41M45M47M4856.378.563.235.448.250.18

17、1.842.11007595.576.476.385.28541.260.370.390.957.9100859688.295.196.393.685.286.381.3100100100100100 100 接種十天后，葉片及芽外植體變綠且變厚，接觸到培養(yǎng)基的外植體表面長出米粒狀的白色愈傷組織。對比發(fā)現(xiàn)M3、M5、M6、M10、M12、M13、M38、M40、M41、M45、M47、M48（分屬于六種培養(yǎng)基）效果較好（見表6及圖5），生長速度快且愈傷組織多，六者6-BA濃度在0.1 mgL-1和0.5 mgL-1之間，而生長素濃度范圍較寬在0.1 mgL-1-2 mgL-1，其中又以M40

18、（MS+6-BA 0.1 mgL-1 +NAA 1 mgL-1）效果最好。因此較理想的金銀花愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是MS+6-BA 0.1 mgL-1 +NAA 1 mgL-1。分析這些培養(yǎng)基上培養(yǎng)時間與誘導(dǎo)率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，實際誘導(dǎo)率百分值越來越接近。這可能與生長激素濃度隨時間延長發(fā)生變化有關(guān)，具體變化規(guī)律尚需進一步研究。 2.3 不定芽的誘導(dǎo)與分化將誘導(dǎo)出的愈傷組織切成小塊作為外植體,轉(zhuǎn)接到成芽培養(yǎng)基上。15天后，愈傷組織產(chǎn)生大量不定芽。對比發(fā)現(xiàn)，在MS+6-BA0.1 mgL-1+NAA 0.02 mgL-1培養(yǎng)基上芽的分化最多、最快，而隨著6-BA和NAA濃度的升高，產(chǎn)芽率明顯減少。The Inducement and Differentiation of Calli in Tissue Cul