基因工程抗體研究綜述

1、基因工程抗體第一節(jié)抗體總論一 抗體研究歷史（一）抗體一詞的由來(lái)抗體的實(shí)驗(yàn)研究始于上世紀(jì)末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉?xiàng)U菌的培養(yǎng)上清分離到可溶性毒素，后者注入動(dòng)物內(nèi)可引起典型的白喉發(fā)病癥狀。Von Behring及同事Kitasato(北里)報(bào)告，以白喉或破傷風(fēng)毒素免疫動(dòng)物后，其血清中可產(chǎn)生一種中和毒素的物質(zhì)，該物質(zhì)能阻止毒素引發(fā)的疾病，來(lái)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗血清用于感染的患兒，獲得明顯的治療效果，尤其是在發(fā)病的早期。于是將能中和毒素的物質(zhì)稱為抗毒素(antitoxin)，隨后引入抗體一詞，泛指抗毒素一類的物質(zhì)，而將引起相應(yīng)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)稱為抗原（antigen）。1

2、896年Gruber和Durham發(fā)現(xiàn)了凝集素。1897年Draus發(fā)現(xiàn)可與相應(yīng)抗原形成沉淀反應(yīng)的抗體，稱為沉淀素。于是認(rèn)識(shí)到毒素及細(xì)菌之外的眾多蛋白質(zhì)均可誘導(dǎo)相應(yīng)抗體的生成，是一種廣義的免疫現(xiàn)象。直至本世紀(jì)30年代，“抗體”一詞才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用電泳方法證實(shí)抗體的活性存在于泳動(dòng)速度最慢的血清組分，稱為丙種球蛋白（gammaglobulin）。免疫后的抗血清的電泳圖形中，gamma球蛋白明顯升高，抗血清經(jīng)相應(yīng)抗原吸收后再電泳，其gamma球蛋白又恢復(fù)到正常血清圖形相同。在之后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，人們?cè)鴮⒖贵w與gamma球蛋白作為同義詞相互用。但事實(shí)上，具有

3、抗體活性的球蛋白并不都泳動(dòng)至gamma組分，反之在gamma組分的球蛋白并不都具有抗體活性。在1968年和1972年世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)所屬專門委員會(huì)決定，將具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可見(jiàn)，抗體是一個(gè)生物學(xué)和功能的概念，可理解為能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白則是一個(gè)結(jié)構(gòu)概念，除抗體外，它尚包括正常個(gè)體中天然存在的免疫球蛋白及病理情況下（如骨髓瘤，巨球蛋白血癥及冷球蛋白血癥等）患者血清中的免疫球蛋白及其亞單位等，因此，抗體是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗體活性，至少目前尚不了解這此天然

4、的或病理的球蛋白的免疫功能。（二）抗體的結(jié)構(gòu)及其多樣性由上述可知，30年代末期人們即已認(rèn)識(shí)到抗體為大分子的球蛋白，通過(guò)研究還表明抗體為雙功能分子，既能與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合，又具有固定補(bǔ)體，穿透胎盤等功能，但有關(guān)其精確的化學(xué)結(jié)構(gòu)卻所知甚少。1958年牛津大學(xué)的Rodney R. Porter以木瓜蛋白酶水解抗體分子，獲得兩個(gè)Fab和一個(gè)Fc片段，前者具有與相應(yīng)抗原結(jié)合的功能，后者則具有其他生物學(xué)功能，洛克菲勒大學(xué)的Gerald M. Edelman采用來(lái)自骨髓瘤患者的均質(zhì)免疫球蛋白，經(jīng)過(guò)還原后證實(shí)免疫球蛋白含有兩條重鏈及兩條輕鏈，在此基礎(chǔ)上Porter、Edelman及眾多實(shí)驗(yàn)室均致力于免疫球蛋

5、白氨基酸序列的闡明。1969年，Edelman及同事最終成功地解出了免疫蛋白的一級(jí)序列1，并發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白由若干功能區(qū)（domain）所構(gòu)成，與抗原結(jié)合的功能區(qū)具有較高的變異性，其他功能區(qū)則相對(duì)保守。免疫球蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)的闡明雖然為抗體的多樣性(diversity)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，但并不能解釋其形成的機(jī)制，根據(jù)推算，抗體的多樣性可達(dá)108109，一個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼一條肽鏈的經(jīng)典概念顯然與之相勃。70年代末至80年代初，日本學(xué)者利根川進(jìn)(Tonegawa)用核酸分子雜交技術(shù)研究了B細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中抗體基因結(jié)構(gòu)的變化，闡明了免疫球蛋白的V區(qū)基因的重排與突變構(gòu)成其無(wú)限組合的可能性，從而解釋了抗體多樣性

6、的起源2。（三）抗體產(chǎn)生技術(shù)自上世紀(jì)末，以抗原免疫動(dòng)物獲得抗血清這一途徑一直是獲得抗體的經(jīng)典方法。1975年Kohler及Milstein建立了B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，這是抗體產(chǎn)生的重大技術(shù)革命。該技術(shù)的普及使得眾多科學(xué)家通過(guò)細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單隆抗體。由于單抗特異性強(qiáng)，性質(zhì)均一，易于大量生產(chǎn)，在生命科學(xué)研究及醫(yī)學(xué)實(shí)踐方面作出了杰出的貢獻(xiàn)，并形成產(chǎn)業(yè)，成為生物技術(shù)的重要支柱之一。然而，單抗多為鼠源性，采用類似的原理制備人源單抗遲遲未獲進(jìn)展，極大地限制了單抗作為治療制劑在人體內(nèi)的應(yīng)用。為克服鼠源單抗的異源性反應(yīng)，80年代中期人們開(kāi)始嘗試基因工程方法改造鼠源單抗，即所謂單抗的“人源化（

7、humanized antibody）”，包括鼠Ig的V區(qū)與人Ig的C區(qū)拼接而成的嵌合抗體，或?qū)⑹驣gV區(qū)的CDR區(qū)移植到人Ig的V區(qū)拼接成的改型抗體3。同時(shí)，考慮到完整抗體的分子過(guò)大，不利于發(fā)揮“藥物”的作用，從而采用基因工程方法使之“小型化”，如單鏈抗體（single chain antibody），為VH與VL直接相連，分子量?jī)H為完整抗體的1/6。以基因操作的方式制備抗體卻始于1989年底英國(guó)劍橋Winter小組與Scripps研究所Lerner小組創(chuàng)造性的工作，他們采用PCR方法克隆抗體全部的可變區(qū)基因（reptoire）并裝于原核表達(dá)載體中，以標(biāo)記抗原即可篩選到相應(yīng)抗體，當(dāng)時(shí)稱為組合

8、抗體庫(kù)技術(shù)。90年代初期，這一技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展，即將抗體基因（VH或Fd）與單鏈?zhǔn)删w的外殼蛋白合并表達(dá)于噬菌體表面，以固相化的抗原吸附相對(duì)應(yīng)的噬菌體抗體，經(jīng)多次“吹附洗脫擴(kuò)增”即可篩選得所需抗體。這是抗體產(chǎn)生的又一次重大技術(shù)革命，首先該技術(shù)將抗體的基因型及表型密切連系起來(lái)，每輪操作可使特異性抗體富集102-103。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)不僅擺脫了細(xì)胞融合等繁瑣的操作，而且可不經(jīng)免疫制備抗體，為制備人源抗體開(kāi)辟了新途徑。這一點(diǎn)已為實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，然而由一個(gè)未經(jīng)免疫的初級(jí)抗體庫(kù)中篩選出理想的抗體肯定不是一件輕松的事情，由于人體不能隨意免疫，轉(zhuǎn)人Ig基因小鼠的嘗試80年代后期即有進(jìn)行，免疫后約4%的抗體

9、為人源。新近這一技術(shù)有了重大突破，首先采用同源重組技術(shù)將小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）中的鼠Ig基因敲除（knock out），而后采用融合技術(shù)將YAC庫(kù)中大片段人Ig基因（200MB）導(dǎo)入，篩選后代即可獲得免疫后僅產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)人Ig基因小鼠的商品化并與噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)相結(jié)合，終于使多年徘徊不前的人源抗體的產(chǎn)生取得了突破。由多克隆抗體到單克隆抗體，直至噬菌體抗體，由不均質(zhì)的異源抗體到均質(zhì)的異源性抗體，直至人源抗體，是抗體產(chǎn)技術(shù)的三個(gè)時(shí)代，從一個(gè)側(cè)面反映了生命科學(xué)由整體水平、細(xì)胞水平、到基因水平水平的進(jìn)展，同時(shí)也為抗體作為醫(yī)藥生技術(shù)產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要支柱奠定了基礎(chǔ)。第二節(jié)抗體的結(jié)構(gòu)和功能一、

10、抗體的分子結(jié)構(gòu)（一）、抗體分子的基本結(jié)構(gòu)盡管抗體分子是一個(gè)極不均一的分子群，既有許多不同的類和亞類，又表現(xiàn)出各不相同的抗原特異性，但所有抗體分子都有著相同的基本結(jié)構(gòu)：二條相同的重鏈和二條相同的鏈組成的免疫球蛋白單體，重鏈（heavy chain）為分子量在5070KD的多肽鏈，輕鏈（light chain）,較短，分子量在23KD左右，每一條肽鏈可分為二個(gè)區(qū)域，重鏈氨基端的四分之一或五分之一與輕鏈氨基端的二分之一的氨基酸序列在不同抗體分子之間變化較大，稱作可變區(qū)，其余部分稱為恒定區(qū)，免疫球蛋白單體是對(duì)稱性的分子，一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈以一個(gè)二硫鍵和非共價(jià)鍵結(jié)合在一起，二個(gè)重鏈又靠非共價(jià)鍵及一個(gè)或多

11、個(gè)二硫鍵接在一起形成免疫球蛋白單體，有些抗體分子是由多個(gè)單體連接起來(lái)形成多聚體，如IgM可為五聚體，IgA可為二聚體。早在50年代末期，Porter和Nisonoff通過(guò)將免疫球蛋白用蛋白酶消化成不同的片段研究免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)，使人們對(duì)免疫球蛋白的基本組成有的初步的了解，由此形成對(duì)免球蛋白片段的命名也延用至今，在免疫球蛋的研究中仍在廣泛使用。Porter用木瓜蛋白酶（papain）消化免疫球蛋白單體可得到二個(gè)相同的Fab(fragment with antigen binding)和一個(gè)Fc(fragment of crystallization)，前者可以和抗原結(jié)合，后者則與抗體的效應(yīng)功有有

12、關(guān)。Nisonoff用胃蛋白酶水解得到由二個(gè)Fab段構(gòu)成的片段，這是因?yàn)槟竟系鞍酌冈谥劓滈g二硫鍵的羧基側(cè)切斷了重鏈，從而二個(gè)Fab段仍由鏈間二硫鍵連接在一起，而剩余的Fc段則水解成小分子肽。這一研究，結(jié)合電鏡觀察結(jié)果，導(dǎo)致了經(jīng)典免疫球蛋白單體的Y型結(jié)構(gòu)模式，其二個(gè)臂為每一個(gè)Fab段，由一個(gè)輕鏈和部分重鏈組成，F(xiàn)c段則包含剩下的重鏈。除了Fab,Fc段和F(ab')2段，免疫球蛋白分子還可以分成其它不同的片段，VH為重鏈可變區(qū)，VL為鏈可變區(qū)。Fv是VH和VL結(jié)合在一起的片段，是抗體與抗原結(jié)合的最基本的單位，VH和VL之間沒(méi)有二硫鍵，而是靠共非價(jià)鍵結(jié)合在一起的，在濃度較低的溶液中易于解離

13、，F(xiàn)d段為Fab段中的重鏈部分，這些不同的片段對(duì)基因工程抗體的組建有重要的意義。（二）抗體分子的功能區(qū)結(jié)構(gòu)抗體分子的輕鏈和重鏈都有若干個(gè)結(jié)構(gòu)類似的功能區(qū)組成，每一個(gè)功能區(qū)含有大約110個(gè)左右氨基酸，內(nèi)有二個(gè)半胱氨酸，二者間隔約60個(gè)氨基酸，所形成的鏈內(nèi)二硫鍵使功能區(qū)成為一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將不同功能區(qū)的氨基酸進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)它們之間有明顯的同源性，即有些位置的氨基酸有著高度保守性，如形成二硫鍵的二個(gè)半胱氨酸，與第一個(gè)半胱氨酸相隔約14個(gè)氨基酸的色氨酸等等，因此所有的功能區(qū)都有非常類似的立體結(jié)構(gòu)：它們含有二個(gè)反向平行折疊片，這二個(gè)片層由鏈內(nèi)二硫鍵連在一起，互相作用，形成一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)；其核心為疏水區(qū)；在

14、恒定區(qū)，一個(gè)折疊片層含有四個(gè)反向平行肽鏈，另一個(gè)含有三個(gè)反向平行肽鏈，可變區(qū)與此類似，但二個(gè)折疊片都含有四個(gè)反向平行肽鏈，在反向平行鏈折返處的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列的保守性要低一些，可變區(qū)這些環(huán)形成了抗原結(jié)合部位。輕鏈含有二個(gè)功能區(qū)，氨基端為可變區(qū)，羧基端恒定區(qū)，重鏈在不同的類或亞類可以有四個(gè)功能區(qū)或五個(gè)功能區(qū)，其氨基端為可變區(qū)，其余是恒定區(qū)，大部分重鏈在CH1和CH2之間有一個(gè)絞鏈區(qū)，絞鏈區(qū)的長(zhǎng)度在1060多個(gè)氨基酸之間不等，其中IgD和IgG3的最長(zhǎng)，分別含有64個(gè)和62個(gè)氨基酸殘基，絞鏈區(qū)含有較多的脯氨酸殘基，富有柔性，可賦予Fab段較大的自由活動(dòng)，有利于抗體和抗原的結(jié)合，絞鏈區(qū)還有不等

15、數(shù)目的半胱氨酸，參于重鏈間二硫鍵的形成，由于絞鏈區(qū)較為伸展，易被蛋白酶消化。輕鏈和重鏈的可變區(qū)互相作用構(gòu)成Fv段，形成抗原結(jié)合部位，可變區(qū)是在分析了大量免疫球蛋白氨基酸序列的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其變化較多而得名。但分析結(jié)果表明氨基酸序列的變異并非隨機(jī)地分布在整個(gè)可變區(qū)，而是集中在較小區(qū)段，這些區(qū)域被稱為高變區(qū)，超變區(qū)，或互補(bǔ)決定區(qū)。輕鏈可變區(qū)有三個(gè)CDR區(qū)，按Kabat編號(hào)系統(tǒng)，其CDR1位于第2434位氨基酸，CDR2位于第5056位氨基酸，CDR3位于8997位氨基酸。由于可變區(qū)的長(zhǎng)度變化，在不同的種屬或不同的亞群，第27位可有16個(gè)氨基酸，第95位也可有16個(gè)氨基酸，它們?cè)谠幪?hào)的基礎(chǔ)上加上英文

16、字母進(jìn)行編位，如27A，27B，95A，95B等待，在重鏈可變區(qū)，初期曾認(rèn)為有四個(gè)高變區(qū)，后經(jīng)抗原親和標(biāo)記及立體構(gòu)形分析，發(fā)現(xiàn)組成抗原結(jié)合部位的只有三個(gè)，故現(xiàn)在公認(rèn)重鏈也有三個(gè)CDR區(qū)，它們分別位于第3135位，5065位，95102位氨基酸，同輕鏈可變區(qū)類似，在35位，52位82位及100位也可有多個(gè)氨基酸，以A，B，C，D等號(hào)，在可變區(qū)的立體構(gòu)象中，CDR區(qū)位于連接反向平行折疊鏈環(huán)部，通過(guò)X線晶體衍射分析證實(shí)CDR區(qū)位于Fab段的未端，是抗體和抗原結(jié)合的部位。尤其是近年將小鼠單克隆抗體的CDR區(qū)移植到人抗體骨架區(qū)，使改型后的人單抗獲得了與親本鼠單抗相同的抗原特異性，更是確定無(wú)疑地證實(shí)了CD

17、R區(qū)是抗體與抗原的結(jié)合部位。(三)免疫球蛋白的不均一性免疫球蛋白是一組理化性質(zhì)極不均一的蛋白分子，這種不均一性來(lái)自免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，對(duì)免疫球蛋白不均一性的研究最初是通過(guò)將免疫球蛋白作為抗原進(jìn)行體內(nèi)免疫，對(duì)抗血清進(jìn)行血清學(xué)分析，對(duì)異種進(jìn)行免疫主要鑒定同種型，對(duì)同種進(jìn)行免疫主要分析同種異型，在同系動(dòng)物或同一個(gè)體內(nèi)則可分析獨(dú)特型，這些血清學(xué)分析反映了免疫球蛋白在不同層次上組成成分的差異。1.同種型同種型指同一物種內(nèi)共同具有抗原特異性，存在于恒定區(qū)，輕鏈稱作型和亞型，重鏈稱為類和亞類。同一種屬內(nèi)每一個(gè)體具有所有型和亞型的輕鏈基因及類和亞類的重鏈基因。(1)輕鏈：輕鏈有二種型

18、別，型和型，它們的分子量都是23KD，由214個(gè)氨基酸組成。在人類，鏈只有一個(gè)恒定區(qū)基因，不存在亞型，而鏈有多個(gè)恒定區(qū)基因。目前已鑒定出四個(gè)有功能的基因，即四個(gè)亞型，這四個(gè)亞型之間只有數(shù)個(gè)氨基酸的差別，由三個(gè)血清學(xué)標(biāo)記所組成，其中第152位為甘氨酸時(shí)為kern+,為絲氨酸時(shí)為kern-4，第190位為賴氨酸時(shí)叫做Oz+，為精氨酸時(shí)叫做Oz-5，第112,114,163位為天門冬酰氨，蘇氨酸和賴氨酸時(shí)為mcg+，為丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸時(shí)為mcg-6，這四種亞型分別為mcg+ke+Oz-，mcg-ke-Oz，mcg-keOz+，以及mcg-ke+Oz-。在人類抗體分子中，約60%為鏈，40%為鏈

19、，在小鼠，約95%為鏈，這是因?yàn)樾∈笾挥卸€(gè)可變區(qū)基因，而鏈可變區(qū)基因在100個(gè)以上。(2)重鏈：哺乳類的重鏈可分為五類，和，某些類又可分為亞類，如在人類可分為四個(gè)亞類：1，2，3和4,可分為兩亞類1和2。因此共有九個(gè)類和亞類，表明基因組內(nèi)有九個(gè)有功能的重鏈恒定區(qū)基因，在小鼠，鏈也可分為四個(gè)亞類，1，2a,2b和3，重鏈的類和亞類決定了免疫球蛋白的類和亞類：它們是-IgM，1-IgG1，2-IgG2，3-IgG3，4-IgG4，1-IgA1，2-IgA2，-IgE，-IgD。免疫球蛋白的類和亞類與其含有的輕鏈型別無(wú)關(guān)，例如IgG1的組成成分可以是（1）2，也可以是（1）2。不同類或亞類的免疫球

20、蛋白在分子結(jié)構(gòu)，血清濃度，體內(nèi)分布，以及生物學(xué)功能上互不相同1）.IgG：IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，約占血清免疫球蛋白總量的75%。在人類的四個(gè)亞類中，其中IgG1含量最多，約占IgG總量的60%。IgG是機(jī)體抵抗病毒和細(xì)菌感染，中和毒素的重要抗體，并且是唯一可以通過(guò)胎盤使新新生兒獲得被動(dòng)免疫保護(hù)的抗體。不同亞類IgG的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性各不相同。2）IgM：IgM約占血清免疫球蛋白總量的10%，是初次免疫反應(yīng)中最先產(chǎn)生的抗體，其鏈沒(méi)有鉸鏈區(qū)但有四個(gè)恒定區(qū)，血清中的IgM是由五個(gè)單體IgM組成的五聚體，分子量達(dá)900kDa，是分子量最大的免疫球蛋白分子，故又稱巨球蛋白。單體IgM是

21、由CH3內(nèi)半胱氨酸形成鏈間二硫鍵而組成的五聚體，在五聚體內(nèi)還有另外一個(gè)多肽鏈，稱作J鏈，與兩個(gè)單體的羧基端以鏈間二硫鍵相連。IgM五聚體有多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，如果結(jié)合半抗原可成十價(jià)，一般情況下由于空間位阻表現(xiàn)為五價(jià)。IgM可產(chǎn)生較強(qiáng)的補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和凝聚反應(yīng)。膜表面型IgM是B細(xì)胞表面的主要免疫球蛋白，它和另外兩個(gè)膜表面蛋白Ig和Ig形成受體復(fù)合物，是B細(xì)胞識(shí)別抗原而被活化的受體。3）IgA：IgA約占血清免疫球蛋白總量的15%，但在消化道分泌液，呼吸道分泌液，乳液，淚液等外分泌液中，它是主要的免疫球蛋白，稱作分泌型IgA。IgA有兩個(gè)亞類IgA1和IgA2，血清中的IgA絕大多數(shù)為單體以IgA1

22、為主。在外分泌液中則主要為雙聚體，也有一些多聚體，以IgA2為主。外分泌液中的雙聚體IgA是由J鏈在羧基端以鏈間二硫鍵連在一起，除了J鏈它還含有另外一個(gè)多肽鏈，稱為分泌小體。這些肽鏈?zhǔn)侨绾芜B接在一起的現(xiàn)在還不十分清楚。在人類，分泌小體纏繞在雙體IgA分子上，以共價(jià)鍵結(jié)合在一起。sIgA是粘膜局部抗感染免疫的重要成分，是通過(guò)乳汁將母親的免疫力傳給新生兒的重要途徑。4）IgE：IgE是血清中含量最少的免疫球蛋白，僅為0.3ug/ml左右，重鏈有四個(gè)恒定區(qū)，沒(méi)有絞鏈區(qū)。IgE含量最低，卻具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性。IgE可與肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞表面的I 型IgE Fc受體（FcRI）結(jié)合，當(dāng)IgE結(jié)合特異

23、性抗原而發(fā)生交連時(shí)，可激活這些細(xì)胞，使其脫顆粒，釋放多種血管活性物質(zhì)，如組織胺，5羥色氨等，導(dǎo)致I型過(guò)敏反應(yīng)。IgE在抗寄生蟲(chóng)免疫中有重要功能。在單核巨噬細(xì)胞和噬酸性粒細(xì)胞表面有II型受體，可介導(dǎo)依賴于抗體的抗寄生蟲(chóng)細(xì)胞毒效應(yīng)。5）IgD：IgD在血清中含量也很低，約40ug/ml左右，它極易被蛋白酶水解，在血清中半衰期很短，為三天左右。人類鏈有三個(gè)恒定區(qū)，在小鼠只有二個(gè)恒定區(qū)，CH1和CH2。IgD的絞鏈區(qū)有64個(gè)氨基酸，是免疫球蛋白中最長(zhǎng)的絞鏈區(qū)，這可能是IgD易被水解的原因。IgD的生物學(xué)功能尚不明確，它和IgM一起組成了B細(xì)胞表面的主要抗原受體，推測(cè)在B細(xì)胞的活化中其重要作用。2.同種

24、異型同種異型指一種屬內(nèi)不同群體間免疫球蛋白分子所具有的不同抗原決定基，同人類血型一樣，是由等位基因的多態(tài)性所造成的。因此每一個(gè)個(gè)體的特定的免疫球蛋白肽鏈可以有一種（純合子）或兩種（雜合子）。由于某一種同種異型只存在于同一種屬一部分個(gè)體內(nèi)，一般用同種抗血清來(lái)鑒定同種異型。在人類發(fā)現(xiàn)和重鏈，輕鏈存在有同種異型，分別命名為Gm,Am和Km。這些同種異型實(shí)際上反映了恒定區(qū)中個(gè)別氨基酸的差異。例如Km同種異型有三種，是由第153位和191位氨基酸引起，這些差異可誘發(fā)同種抗血清，說(shuō)明它們位于分子的表面，其變化可產(chǎn)生新的抗原決定基，這一點(diǎn)已為X射線衍射所證實(shí)。IgG的四個(gè)亞類都存在有Gm因子，是由gamma

25、鏈恒定區(qū)個(gè)別氨基酸的差異所產(chǎn)生。人類IgA2發(fā)現(xiàn)了二個(gè)同種異型，命名為Am(1)和Am(2)，它們之間有四個(gè)氨基酸不同。決定同種異型的等位基因是共顯性，因此在雜合子個(gè)體，血清中二種同種異型都存在，但在每一個(gè)抗體分子中，由于等位基因排斥（allelic exclusion），其二個(gè)重鏈的同種異型總量是相同的，同種異型的遺傳遵循孟德?tīng)柖伞＊?dú)特型是指每一個(gè)抗體形成細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體分子上所有的抗原特異性，是由輕鏈或重鏈可變區(qū)氨基酸序列不同所決定的，因此與抗體接合抗原的特異性密切相關(guān)。由于機(jī)體內(nèi)存在有針對(duì)各種不同抗原的抗體，因此一個(gè)個(gè)體內(nèi)有數(shù)量眾多的獨(dú)特型，在自身體內(nèi)可產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體，這種獨(dú)特型-

26、抗獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)控有著重要的作用7。二、抗體分子的基因結(jié)構(gòu)與重排 機(jī)體內(nèi)有成千上萬(wàn)的B細(xì)胞，每一個(gè)B細(xì)胞克隆都表達(dá)有特異性的抗原受體，即膜表面Ig。不同B細(xì)胞克隆所表達(dá)的抗原受體具有不同的特異性，說(shuō)明每一個(gè)個(gè)體都存在著數(shù)量巨大的抗原受體，即抗體的多樣性，它是由免疫球蛋白可變區(qū)，尤其是CDR區(qū)決定的。另一方面，免疫球蛋白的恒定區(qū)具有類、亞類、型和亞型等有限的變化，恒定區(qū)的變化與可變區(qū)的多樣性完全分離，同一個(gè)亞類重鏈可具有多種不同的可變區(qū)，而同一個(gè)可變區(qū)又可與不同類或亞類的恒定區(qū)組成重鏈。自從五十年代以后，隨著免疫球蛋白氨基酸序列資料的積累使免疫球蛋白分子的基本結(jié)構(gòu)得到闡明，就提出了二個(gè)

27、最基本的問(wèn)題：從可變區(qū)和恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)來(lái)看，似乎有著不同的遺傳來(lái)源，它們?nèi)绾螘?huì)存在于同一條肽鏈？如此巨大數(shù)量的可變區(qū)是如何形成的？1965年Dryer和Bennet提出了一個(gè)大膽的設(shè)想：免疫球蛋肽鏈?zhǔn)怯啥M基因編碼，一組數(shù)量巨大，含有可變區(qū)的遺傳信息，另一組小得多，含有恒定區(qū)的信息。這與當(dāng)時(shí)公認(rèn)的原則：“一個(gè)肽鏈由一個(gè)基因編碼”相矛盾。按照這個(gè)設(shè)想，一條肽鏈可以由二個(gè)基因或至少是二個(gè)基因片段編碼，它還意味著可變區(qū)和恒定區(qū)基因必須拼接在一起才能轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)分子。由于當(dāng)時(shí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段不足，支持Dryer和Bennet假設(shè)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)直到10年以后才出現(xiàn)?，F(xiàn)在我們已知道Ig肽鏈

28、由不止一個(gè)基因編碼的設(shè)想的原則是正確的，但免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)和重組遠(yuǎn)較Dryer和Bennet設(shè)想的要復(fù)雜的多。（一)抗體基因的基本結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的鏈基因、鏈基因和重鏈基因位于不同的染色體。在生殖細(xì)胞系或在除B細(xì)胞以外的其它細(xì)胞中，可變區(qū)和恒定區(qū)編碼的基因片段在基因組DNA上是分開(kāi)的。輕鏈和重鏈的基因結(jié)構(gòu)又互不相同。 (1)鏈：人和鼠的鏈基因結(jié)構(gòu)非常類似，由三種分離的基因片段組成，它們是Vk，Jk和Ck。Ck編碼恒定區(qū)，只有一個(gè)基因。J基因段編碼鏈可變區(qū)第96108位氨基酸8，人和鼠都有五個(gè)J基因段，小鼠的Jk3沒(méi)有功能，因其3端缺乏RNA拼接信號(hào)(內(nèi)含子5端的剪接信號(hào)為GT，但在小鼠Jk3

29、的3端是CT)93.7kbp。Jk與Vk在人類相距23kbp。Vk 編碼鏈可變區(qū)的195位氨基酸，其確切數(shù)目還不確定，目前估計(jì)約有100多個(gè)Vk基因，其中有相當(dāng)一部分不能合成有功能的蛋白質(zhì)，稱做假基因(pseudogene)。其原因有編碼區(qū)出現(xiàn)終止密碼子，因插入或缺失造成的閱讀框架位移，或因關(guān)鍵氨基酸突變使所產(chǎn)生的蛋白無(wú)法進(jìn)行正確折疊等10。假基因雖不能直接與J鏈拼接成有活性的可變區(qū)基因，但它們?nèi)钥勺鳛榭勺儏^(qū)信息庫(kù)通過(guò)基因轉(zhuǎn)換(gene conversion)或不對(duì)稱重組增加鏈的多樣性。 典型的Vk基因含有上游調(diào)控序列，前導(dǎo)序列。在前導(dǎo)序列內(nèi)含有一個(gè)內(nèi)含子。序列所編碼的前導(dǎo)肽對(duì)抗體分子進(jìn)入粗面

30、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最終表達(dá)在細(xì)胞膜表面或分泌到胞外有重要作用。當(dāng)免疫球蛋白的肽鏈進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，前導(dǎo)肽被信號(hào)肽酶切去，故前導(dǎo)肽不存在于成熟免疫球蛋白分子。 Vk基因可根據(jù)其序列相似程度不同分成不同的亞群，一般將DNA序列有的80以上相同的Vk基因片段歸為一個(gè)亞群。在DNA雜交實(shí)驗(yàn)中，同一亞群的Vk基因可在較嚴(yán)格的條件下雜交，而不同的亞群之間的雜交信號(hào)很弱。亞群的劃分是人為的，有些Vk基因難于歸入某個(gè)亞群。但亞群在一定程度上反映了可變區(qū)基因在種系進(jìn)化中的關(guān)系。目前在人類發(fā)現(xiàn)有七個(gè)亞群。在鏈基因位點(diǎn)中，同一亞群的Vk基因有分布于同一區(qū)域的趨勢(shì)。但不同亞群的Vk基因群常?；旌戏植?，可能與進(jìn)化過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)

31、位(transposition)和基因擴(kuò)增有關(guān)。 Vk基因分布在至少2000kbp范圍的基因組DNA內(nèi)，其確切邊界和其位點(diǎn)內(nèi)是否含有其它基因還不清楚。(2)鏈：鏈也由三個(gè)基因片段編碼，V和J組成可變區(qū)，V編碼195位氨基酸，J編碼96108位氨基酸，恒定區(qū)由獨(dú)立的外顯子編碼。由于k鏈有不同的亞型，每一個(gè)亞型有各自的恒定區(qū)基因。鏈基因的結(jié)構(gòu)與鏈有所不同，每一個(gè)C基因有其自己的J基因片段，形成J-C結(jié)構(gòu)，而J-C基因集中在一起形成J基因群。人類有七個(gè)C基因，J與V基因相距14kbp，在七個(gè)V基因中C1相應(yīng)于mcg+亞型，C2相應(yīng)于ke-Oz-亞型，C3相應(yīng)于ke-oz+亞型，C4、C5和C6為無(wú)功

32、能的假基因，C7屬ke+oz-亞型。人類V基因目前鑒定出十個(gè)亞群，最近已克隆出了36個(gè)V基因，其中12個(gè)為假基因，從DNA印跡雜交實(shí)驗(yàn)估計(jì)人類V基因的總數(shù)可能在70個(gè)左右。在小鼠則僅有二個(gè)V基因，這與小鼠血液中只有5%Ig含有輕鏈相一致。小鼠有四個(gè)V-C基因，每一個(gè)V基因跟隨著二個(gè)JC，V1后面是J1C1和J3C3，V2后面是J2C2和J2-C4，其中J4-C4是假基因，在J和C1.4kbp的內(nèi)合子。V2可以和任何一個(gè)JC重組，而V只可以和J3，J1發(fā)生重組。 重鏈基因和輕鏈基因的結(jié)構(gòu)有二點(diǎn)主要區(qū)別：一是可變區(qū)由三個(gè)基因片段編碼，它們是VH(varlable)，D(diversity)和JH(

33、joining)。二是重鏈所有同種型的恒定區(qū)基因集中在一起，位于可變區(qū)基因段的下游。VH基因與輕鏈的V基因類似，由二個(gè)外顯子組成，第一個(gè)外顯子編碼大部分前導(dǎo)肽，第二個(gè)外顯子編碼前導(dǎo)肽羧基端四個(gè)氨基酸和可變區(qū)195位氨基酸，二個(gè)外顯子之間有大約100個(gè)鹼基對(duì)左右的內(nèi)含子。人類VH的數(shù)目現(xiàn)已比較清楚，大約有50個(gè)左右具有功能的VH基因，共分六個(gè)亞群。另有約幾十個(gè)假基因，具體數(shù)目尚不清楚。假基因可通過(guò)間接方式增加抗體的多樣性。小鼠VH數(shù)目尚不確定，估計(jì)數(shù)百個(gè)左右，共分十個(gè)亞群。 D基因片段所編碼的肽段構(gòu)成了CDR3的主要成分，它沒(méi)有固定的閱讀框架，且長(zhǎng)短不一，短者可僅編碼三個(gè)氨基酸，長(zhǎng)者可編碼十幾個(gè)

34、氨基酸，因此其確切數(shù)目難以估計(jì)。目前在人類已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)D基因，在小鼠發(fā)現(xiàn)十幾個(gè)D基因。D基因群在VH基因群和JH基因群之間，分布在大約70一80kbp的DNA范圍內(nèi)，在VH基因之間也可以發(fā)現(xiàn)散在的D基因片段11。 在D基因群的下游是JH基因群，JH編碼重鏈可變區(qū)羧基端1621個(gè)氨基酸，其氨基端的49個(gè)氨基酸與D片段共同組成CDR3。人類有九個(gè)J基因段，其中有三個(gè)假基因，小鼠有四個(gè)J基因段。距JH基因群下游約7000個(gè)鹼基為重鏈恒定區(qū)基因群。重鏈恒定區(qū)基因群含有所有重鏈同種型的恒定區(qū)基因，在小鼠有八個(gè)恒定區(qū)基因，分布在200kbp的范圍內(nèi)，在人類有11個(gè)恒定區(qū)基因，其中有二個(gè)假基因，其確切長(zhǎng)度

35、尚不清楚。恒定區(qū)基因之間除C和C之間相隔45kbp外其它都相距數(shù)萬(wàn)個(gè)鹼基，每一個(gè)恒定區(qū)基因由四到六個(gè)外顯子組成，每一個(gè)功能區(qū)及絞鏈區(qū)由獨(dú)立的外顯子編碼，3端的12個(gè)外顯子為膜型Ig的穿膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)編碼。(二)可變區(qū)基因的重組及其機(jī)制由于可變區(qū)分成數(shù)個(gè)基因片段編碼，每一個(gè)基因片段以基因群的方式存在，因此只有通過(guò)基因重組使各基因片段，即V-J或V-D-J連接起來(lái)才能形成有功能的完整的可變區(qū)基因。1輕鏈可變區(qū)基因的重組輕鏈可變區(qū)基因由V-J重組完成，任何一個(gè)Vk或V基因與某個(gè)Jk或J經(jīng)基因重組連在一起，即可形成一個(gè)有功能的輕鏈可變區(qū)基因。在V-J重組時(shí)，接頭處可發(fā)生核苷酸的錯(cuò)位和變化，從而增加CDR

36、3的多樣性。2重鏈可變區(qū)基因的重組重鏈可變區(qū)基因的重組由于多了D基因片段而較輕鏈更為復(fù)雜。首先發(fā)生的是D-J重組，將一個(gè)D基因片段和一個(gè)JH基因連接起來(lái)，然后進(jìn)行V-J重組，一個(gè)VH基因與重排后的DJ連接形成有功能的重鏈可變區(qū)基因。D-J和V-DJ重組時(shí)接頭處的變化比輕鏈V-J接頭處的變化要大得多，如在D-J和V-DJ重組時(shí)末端的核苷酸可以被酶解，還可通過(guò)末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用加上新的核苷酸，稱作N區(qū)(nongermline encoded nucleotides)12，它大大增加了重鏈可變區(qū)CDR3的多樣性。3可變區(qū)基因重組的機(jī)制 (1)重組信號(hào)序列：V-(D)-J重組的機(jī)制還未完全闡明，但

37、通過(guò)對(duì)這些基因片段兩側(cè)DNA序列的分析，在VH和VL的3端，J基因的5端和D基因的兩端發(fā)現(xiàn)了高度保守的重組信號(hào)序列(recombination signal sequence，RSS)13。它包括一個(gè)七核苷酸組成的七聚體(heptamer)和一個(gè)九個(gè)核苷酸組成的九聚體(nonamer)，二者間隔12土1或23士1個(gè)核苷酸。VL和JL，VH和DH以及DH和JH之間的七聚體和九聚體為反向互補(bǔ)序列，如J基因5端的七聚體序列為CACTGTG，九聚體序列為ACAAAAACC，分別與V3端的七聚體CACAGTG和九聚體GGTTTTTGT為反向互補(bǔ)序列，這些互補(bǔ)序列可以形成莖-環(huán)狀結(jié)構(gòu)(stem-and-l

38、oop structure)。七聚體和九聚體之間間隔序列的長(zhǎng)度是固定的，為12土1或23土1個(gè)核苷酸它決定了重組的模式，只有間隔12個(gè)鹼基對(duì)和23個(gè)鹼基對(duì)的重組信號(hào)序列之間發(fā)生重組，而間隔長(zhǎng)度相等的重組信號(hào)序列之間不發(fā)生重組，這就是12/23鹼基對(duì)規(guī)律14，由于12或23鹼基對(duì)分別相當(dāng)于DNA雙螺旋的一或二圈，也叫做1+2圈規(guī)律，這個(gè)規(guī)則保證了重組以正確的方式進(jìn)行，尤其在重鏈，只有D-J，V-DJ之間發(fā)生重組，而不會(huì)產(chǎn)生V-J重組。 (2)重組模式：通過(guò)重組信號(hào)序列進(jìn)行重組的具體模式有以下三種： i缺失模式(deletion model)15：以VL-JL重組為例，VL3端的重組信號(hào)序列和JL

39、5端的重組信號(hào)序列通過(guò)七聚體和九聚體形成莖-環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將VL和JL基因端帶到了一起，然后通過(guò)重組酶（recombinase）的作用進(jìn)行切除和連接，將VL和JL連在一起形成完整的輕鏈可變區(qū)基因，而VJ之間的環(huán)，則通過(guò)七聚體末端之間的連接形成一個(gè)環(huán)狀DNA分子。在淋巴細(xì)胞中能檢測(cè)到這種環(huán)狀分子，證明了缺失模式的存在。 ii倒轉(zhuǎn)模式(inversion model)16：當(dāng)重組信號(hào)序列同處于二個(gè)基因段的同一側(cè)時(shí)，上述重組過(guò)程不是造成二個(gè)重組基因間DNA序列的環(huán)化和缺失，而是這段DNA的倒轉(zhuǎn)，倒轉(zhuǎn)后V-J連接成可變區(qū)基因，在D基因段二端均有重組信號(hào)序列，因此DJ重組可通過(guò)以上二種模式進(jìn)行。在基因組中發(fā)

40、現(xiàn)有反向排列的V基因說(shuō)明這些V基因通過(guò)倒轉(zhuǎn)模式進(jìn)行重組，在體外模式實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在二個(gè)方向的重組信號(hào)序列都存在的情況下，倒轉(zhuǎn)模式和刪除模式發(fā)生的幾率幾乎相等。因此，根據(jù)基因組中Vk基因群的排列方向，大約可有半數(shù)Vk-Jk的重組可能涉及倒轉(zhuǎn)模式。 iii姊妹染色體交換模式(sister chromatid exchange model)17：通過(guò)姊妹染色體之間的不對(duì)稱交換或重組(unequal crossing over or recombination)可在二條染色體之間進(jìn)行V-(D)-J重組。這種機(jī)制在理論上可能存在,但尚未發(fā)現(xiàn)直接證據(jù)。 (3)重組涉及的酶：上述各種V-(D)-J重組機(jī)制均涉

41、及到重組信號(hào)序列的識(shí)別，編碼端和七聚體接頭處的切割，DNA斷端鹼基的刪除、添加及修補(bǔ)，以及斷端的連接。這一過(guò)程中所涉及到的酶系統(tǒng)還未完全闡明，目前所了解的有以下幾種： i末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT)18：參與了重組接頭處核苷酸的添加，與N區(qū)的形成密切相關(guān)。 ii發(fā)現(xiàn)了可以與七聚體和九聚體序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中與七聚體結(jié)合的蛋白的編碼基因已被克隆，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。iii目前研究較多的是二個(gè)重組激活基因（recombination activating genes，RAGs）19，RAGl和RAG2，它們?cè)谕换蛭稽c(diǎn)，二者僅相隔幾千個(gè)鹼基對(duì)，但二個(gè)基因之間并無(wú)同源性。RA

42、Gl和RAG2在進(jìn)化中非常保守，如人與小鼠的RAGl有90的氨基酸相同。RAGl和RAG2在V(D)J重組中的具體作用方式尚不明確，但兩者的存在與重組活性密切相關(guān)，將二者同時(shí)轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞即可使原來(lái)沒(méi)有重組酶活性的纖維母細(xì)胞產(chǎn)生重組酶活性而發(fā)生Ig基因重組，說(shuō)明RAG1和RAG2是重組酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分。4CDR3的多樣性 Ig可變區(qū)中以CDR3的變異性最大，有人估計(jì)人重鏈CDR3的多樣性可達(dá)1014以上。事實(shí)上CDR3的多樣性是抗體多樣性的主要來(lái)源，V-(D)-J重組的接頭部位都位于CDR3內(nèi)，重組過(guò)程中有多種機(jī)制可增加其多樣性。 (1)接頭處多樣性(junctional diversity

43、)20：在V-(D)-J重組時(shí)重組信號(hào)序列末端的連接和編碼序列末端的連接有很大差異，信號(hào)序列末端的連接一般較準(zhǔn)確，未發(fā)現(xiàn)有鹼基丟失的現(xiàn)象，添加新的核苷酸的現(xiàn)象也很少發(fā)生。但編碼序列末端的連接一般不準(zhǔn)確，常可見(jiàn)到1-10個(gè)核苷酸的丟失和添加，所添加的核苷酸有二種，一種叫做N區(qū)或N核苷酸(N-region N-nucleotides)，N代表non-germline encoded nucleotides，意為非生殖細(xì)胞系編碼的核苷酸。這種新的核苷酸的添加是由末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)所催化的，一般以GC較為多見(jiàn)，N

44、區(qū)只發(fā)生在重鏈可變區(qū)的DJ和VD接頭處。另一種叫做P核苷酸(P nucleotides)，P取自Palindrom，因?yàn)樗偸青徑诰幋a序列的末端并與編碼序列末端的鹼基互補(bǔ)。P核苷酸一般只有1-2個(gè)鹼基，只存在于完整的編碼序列末端，因此人們推測(cè)P核苷酸的形成是V-(D)-J重組時(shí)的固有特性，它實(shí)際上來(lái)自DNA的互補(bǔ)鏈，通過(guò)二條鏈末端二個(gè)鹼基間的相互連接，同時(shí)在互補(bǔ)鏈倒數(shù)第一二或第二三個(gè)鹼基之間打開(kāi)缺口，使該鏈末端的1-2個(gè)鹼基連到另一條鏈上，造成突出的單鏈末端，再通過(guò)DNA聚合酶補(bǔ)平，形成P核苷酸。因此P核苷酸本質(zhì)上是基因組所攜帶的信息。單鏈突出的末端也可成為DNA外切酶的底物被水解刪除，造成

45、編碼區(qū)末端的缺失，并可通過(guò)TdT活性添加核苷酸形成N區(qū)，因此在有N區(qū)形成時(shí)見(jiàn)不到P核苷酸。 (2)來(lái)源于D基因段的多樣性：由于重鏈可變區(qū)比輕鏈多一個(gè)D基因段，使重鏈的CDR3的多樣性更為突出，除了基因組DNA多副本D基因段和上述接頭處的變化外，還有其他機(jī)制可增加D片段的多樣性： i D片斷沒(méi)有固定的閱讀框架，隨V-D-J重組時(shí)接頭處的變化所決定，因此有三種可能，D-J重組時(shí)可以有缺失模式或倒轉(zhuǎn)模式，后者造成D段的倒轉(zhuǎn)，又增加了三種可能的氨基酸序列，使一個(gè)D基因段可以形成六種不同肽段。 ii D-D融合（D-D fusion）21：由于D基因段二端的重組信號(hào)序列中七聚體和九聚體都是間隔12個(gè)鹼基

46、對(duì)，D-D重組違背1223鹼基對(duì)規(guī)則；但經(jīng)過(guò)大量CDR3序列的分析發(fā)現(xiàn)10以上的CDR3含有融合的DD片段，對(duì)于D-D重組發(fā)生的機(jī)制還不完全明確，有人發(fā)現(xiàn)D基因段內(nèi)存在隱蔽的不典型重組信號(hào)序列，可造成D-D重組，但經(jīng)序列分析，D基因段內(nèi)不典型重組信號(hào)序列存在率不高，不足以解釋如此高頻率的D-D重組。姊妹染色體不對(duì)稱交換可以是D-D重組的機(jī)制之一，但它在體內(nèi)是否D-D重組的真正原因尚不能確定。 iii DIR基因(DH genes with irregular recombination signals)22：在Ig基因組D位點(diǎn)，除了常規(guī)的D基因段，還發(fā)現(xiàn)有約90個(gè)鹼基長(zhǎng)的DNA序列，其兩端有多

47、個(gè)七聚體和九聚體重組信號(hào)序列，在七聚體和九聚體之間的間隔序列既有12個(gè)鹼基也有23個(gè)鹼基，因此它可以形成V-D-DIR-J，V-DIR-D-J及V-D-DIR-D-J等多種不同形式的重組，而增加CDR3的多樣性，目前已發(fā)現(xiàn)有7的人類CDR3含有DIR基因序列。(3)V-V(D)J重組和V(D)J-J重組：V(D)J重組完成以后的可變區(qū)基因還可以和上游的、V基因再次重組，造成VH替換(V replacement)，或和下游的J基因再次重組，這些重組仍可產(chǎn)生接頭處的變化，如形成P核苷酸及N區(qū)。關(guān)于其發(fā)生的機(jī)制目前認(rèn)為存在于VH3端及重組后VDJ基因3端的與重組信號(hào)相類似的序列介導(dǎo)了VVDJ和VDJ

48、-J重組。 5抗體多樣性的來(lái)源 隨著對(duì)Ig基因結(jié)構(gòu)和重組機(jī)制了解的深入，抗體多樣性產(chǎn)生的機(jī)制逐漸得以闡明，大體上可將抗體多樣性的來(lái)源分成三部分： (1)胚系細(xì)胞所攜帶的遺傳信息，它包括多副本的V基因，D基因，J基因及輕鏈重鏈等隨機(jī)配對(duì)所形成的多樣性，如按50個(gè)VH基因，30個(gè)D基因，6個(gè)JH基因，100個(gè)Vk基因，5個(gè)Jk基因計(jì)算,這種細(xì)胞固有的多樣性可達(dá)：50×30×6×100××106 (2)B細(xì)胞個(gè)體發(fā)生過(guò)程中由于V-(D)-J重組時(shí)接頭處的變化所產(chǎn)生的多樣性，這種變化發(fā)生在CDR3,包括重組時(shí)編碼端核苷酸的刪除，添加，P核苷酸和N區(qū)的形

49、成等，其中有些是在基因原有遺傳信息的基礎(chǔ)上的變化，如接頭處不準(zhǔn)確連接所造成的編碼匡架的變化，D段閱讀框架的變化，以及P核苷酸的形成等，有些則與基因DNA中攜帶助信息無(wú)關(guān)，如N區(qū)的形成。據(jù)估計(jì)CDR3的多樣性可達(dá)1014。 (3)體細(xì)胞突變（somatic mutation）23亦稱高突變(hyper mutation)發(fā)生于B細(xì)胞受到抗原刺激后的分化發(fā)育階段。免疫系統(tǒng)在接觸原以前通過(guò)各種機(jī)制已形成了數(shù)量巨大的免疫球蛋白群體(repetoire)，可以結(jié)合自然界中各種各樣的抗原，但這還不足以對(duì)機(jī)體提供充分的免疫保護(hù)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗體的親和力都比較低?？乖M(jìn)入機(jī)體后刺激B細(xì)胞進(jìn)一步分化，同時(shí)抗體基因

50、發(fā)生體細(xì)胞突變，突變后親和力得到改善的細(xì)胞克隆經(jīng)抗原選擇后具有較大的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而在再次免疫反應(yīng)中所產(chǎn)生的抗體具有較高的親和力，這個(gè)親和力增高的過(guò)程叫做親和力成熟(affinity maturation)。親和力成熟過(guò)程中的體細(xì)胞突變僅發(fā)生于重組后的可變區(qū)基因及其3端和5端200個(gè)左右鹼基以內(nèi)而不見(jiàn)于恒定區(qū)，主要是點(diǎn)突變，也可有插入和缺失，其突變率約為10-3-10-4/代，是同一細(xì)胞中其它基因突變率(10-6-10-8)的1000倍以上，這個(gè)突變率是既能產(chǎn)生最大序列多樣性又不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的最佳突變率，體細(xì)胞突變具有以下幾個(gè)特征：對(duì)ACTG四種鹼基沒(méi)有選擇性，也不局限在CDR區(qū)，很少發(fā)生于

51、初次反應(yīng)，尤其初次免疫反應(yīng)早期產(chǎn)生的IgM抗體，沒(méi)有超突變，在分化到漿細(xì)胞后超突變停止，這有利于保證高親和力抗體的持續(xù)性分泌。超突變是T細(xì)胞依賴性的，只見(jiàn)于T細(xì)胞依賴性抗原(TD抗原)誘發(fā)的抗體反應(yīng)。超突變產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確，現(xiàn)已知其發(fā)生的部位在生發(fā)中心(germinal center)，生發(fā)中心是由寡克隆B細(xì)胞在樹(shù)突狀細(xì)胞所呈遞的抗原刺激下增殖所形成，在這增殖過(guò)程中，可變區(qū)基因發(fā)生體細(xì)胞突變，突變后的子代經(jīng)受抗原的選擇，不能與抗原結(jié)合者發(fā)生凋亡(apoptosis)，親和力高者則具備選擇優(yōu)勢(shì)，通過(guò)這一過(guò)程產(chǎn)生高親和力的子代，并進(jìn)一步分化成漿細(xì)胞或記憶性B細(xì)胞。通過(guò)以上多種先天或后天機(jī)制，使抗

52、體可以具有無(wú)限的多樣性，既可使機(jī)體識(shí)別任何一種外來(lái)抗原，又可在抗原刺激后提高抗體的親和力，對(duì)機(jī)體提供有效的保護(hù)作用。第三節(jié)基因工程抗體雜交瘤-單克隆抗體技術(shù)和DNA重組技術(shù)所取得的成就促進(jìn)了基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展，最初出現(xiàn)的基因工程抗體是八十年代初報(bào)道的人鼠嵌合抗體(chimeric antibody)24，隨后出現(xiàn)了人改型抗體(reshaped human antibody)25，小分子抗體，抗體融合蛋白(antibody fusion protein)等在基因水平上經(jīng)過(guò)改造的單克隆抗體。從八十年代末期到九十年代初期，在(1)大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，(2)聚合酶鏈反應(yīng)(poly

53、merase chain reaction PCR)擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因26以及(3)通過(guò)噬菌體表面表達(dá)系統(tǒng)(phagedisplay)進(jìn)行高效篩選等技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上建立了抗體庫(kù)技術(shù)，可通過(guò)基因工程手段在原核細(xì)胞體系直接克隆到特異性抗體的基因。這一革命性的進(jìn)展對(duì)抗體的制備、改造及新型抗體的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了深刻的影響，標(biāo)志著抗體技術(shù)經(jīng)歷了第一代抗體血清多克隆抗體，第二代抗體單克隆抗體發(fā)展到了第三代抗體基因工程抗體。一、基因工程技術(shù)改造的抗體(一)鼠單抗的人源化單克隆抗體的問(wèn)世極大促進(jìn)了抗體在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，在臨床檢測(cè)中發(fā)展了許多以單抗為基礎(chǔ)的檢測(cè)手段，但單抗在體內(nèi)治療上的應(yīng)用發(fā)展緩慢，其主要原因之一是：

54、由于人雜交瘤體系的低效性、迄今的單克隆抗體主要是鼠源性的，鼠源性抗體作為異種蛋白應(yīng)用于人體可引起針對(duì)異種蛋白的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗小鼠抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)27，HAMA既可影響單抗的治療的效果，又可能誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。降低鼠單抗的異源性是解決這一難題的重要途徑之一。目前將鼠單抗人源化的方法有以下幾種：1鼠單抗恒定區(qū)的人源化；人-鼠嵌合抗體(human-mouse chimeric antibody)：抗體分子是雙功能分子，其與抗原特異性結(jié)合的活性存在于輕鏈和重鏈的可變區(qū)，即Fv段?？贵w分子作為異種蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原性則主要存在于恒定區(qū)，因此最初出現(xiàn)的

55、人源化鼠單抗就是將鼠單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)拼接而成的嵌合抗體。它完整地保留了親本鼠單抗的特異性和親和力，同時(shí)大大降低了鼠單抗的異源性。嵌合抗體的構(gòu)建主要涉及以下三部分內(nèi)容(1)可變區(qū)基因的克隆：有二種技術(shù)路線從分泌親本鼠單抗的雜交瘤細(xì)胞中克隆可變區(qū)基因：用適當(dāng)?shù)奶结槒脑撾s交瘤細(xì)胞系的基因組文庫(kù)中釣取28或用PCR方法從細(xì)胞mRNA擴(kuò)增。細(xì)胞基因組中有多個(gè)V基因，只有經(jīng)過(guò)V(D)J重組的V基因才能表達(dá)，因此可用適當(dāng)?shù)腏區(qū)探針從基因組文庫(kù)中釣取含有重組后V基因的克隆，獲得可變區(qū)基因，V(D)J重組造成DNA限制性內(nèi)切酶譜的改變，通過(guò)DNA印跡分析(southern analysis)可將已發(fā)

56、生V(D)J重組的克隆和末發(fā)生重組的克隆區(qū)分開(kāi)。在構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)可先用DNA印跡分析從細(xì)胞DNA酶解物中鑒定出含有重組后可變區(qū)基因的限制性內(nèi)切酶片段、再分離該特定分子量的內(nèi)切酶片段，構(gòu)建可變區(qū)基因富集的基因文庫(kù)，可使篩選工作更易于執(zhí)行。多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的建立和發(fā)展為抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增提供了簡(jiǎn)便有效的方法，盡管抗體分子可變區(qū)有著數(shù)量巨大的多樣性,但其骨架區(qū)的序列相對(duì)保守，其前導(dǎo)序列也相對(duì)保守，因此用第一骨架區(qū)序列或前導(dǎo)序列作為5'端引物，以J段或恒定區(qū)序列的互補(bǔ)DNA為3'端引物,以雜交瘤細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄P

57、CR(RT-PCR)，很容易克隆到可變區(qū)基因。這個(gè)方法較上述基因文庫(kù)法要簡(jiǎn)便容易得多，但有三點(diǎn)缺陷：一是PCR克隆的可變區(qū)基因來(lái)自mRNA，因此沒(méi)有內(nèi)含子剪接信號(hào)和表達(dá)調(diào)控元件，這些成分需由表達(dá)載體提供，載體構(gòu)建難度較大。二是以骨架區(qū)序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)由于引物的簡(jiǎn)并性及必要的內(nèi)切酶位點(diǎn)的引入，可造成個(gè)別氨基酸的改變。盡管抗體的特異性和親和力主要取決于CDR3，骨架區(qū)仍有一定的作用，Ig立體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)氨基端(第一骨架區(qū))的氨基酸殘基涉及到CDR平面的形成，因此骨架區(qū)個(gè)別氨基酸的改變有可能影響抗體的親和力。由前導(dǎo)序列和恒定區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增則可避免這一缺陷，但由于前導(dǎo)肽序列變異較大，引物

58、設(shè)計(jì)難度較高，目前還沒(méi)有把握將100的可變區(qū)基因擴(kuò)增出來(lái)，三是用于PCR的聚合酶多有錯(cuò)配傾向，一般可有千分之幾的錯(cuò)配率，可造成擴(kuò)增產(chǎn)物的改變，因此在擴(kuò)增時(shí)要選取數(shù)個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列分析，以保證所得克隆沒(méi)有PCR引起的突變。(2)表達(dá)載體的構(gòu)建：嵌合抗體的表達(dá)載體因可變區(qū)克隆的方式不同而分成三類：從基因文庫(kù)所克隆的可變區(qū)基因作為獨(dú)立的外顯子帶有上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及內(nèi)含子剪接信號(hào)，因此載體應(yīng)攜帶的基本成分包括：細(xì)菌內(nèi)增殖所必須的抗菌素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制的起始序列(origin)，在真核細(xì)胞進(jìn)行選擇的顯性選擇標(biāo)記基因，人Ig恒定區(qū)基因及3端的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸化信號(hào)(polyadenylation signal)。如從cDNA用PCR法克隆可變區(qū)基因則除上述成分外，載體還需含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，可變區(qū)3端的內(nèi)含子剪接信號(hào)，如從第一骨架區(qū)擴(kuò)增可變區(qū)基因，則載體還需提供前