溶菌酶檢驗標(biāo)準(zhǔn)

1、1 術(shù)語和定義溶菌酶酶活性單位：在25C、pH值為的條件下，于 450nm處每分鐘引起溶酶小球菌體（Micrococcus Lysodeiktidus ）溶液吸光度下降所需要的酶量為一個酶活性單位U。本定義適合“比濁法”。溶菌酶效價：溶菌酶在一定濃度范圍內(nèi)，其對數(shù)計量與抑菌圈直徑（面積）呈對數(shù)關(guān)系，通過檢測其對微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與樣品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算出樣品的效價， 單位為uo本定義適合“管碟法”。2 技術(shù)要求2.1 外觀和性狀要求粉酶為白色或微黃色的結(jié)晶或無定形粉末。2.2 技術(shù)指標(biāo)4.2.1 粉酶水分含量： 12%4.2.2 粉酶粒度：420心m孔徑分析篩篩上物 4%4.2.

2、3 粉酶熾灼殘渣：g %4.2.4 酶活（效價）指標(biāo)表1產(chǎn)品成分分析保證值項目指標(biāo)粉»5 50型溶菌酶酶活性 （效價），）U/g （ u）5000004.2.5 衛(wèi)生指標(biāo)符合GB 13078和NY/T 722的有關(guān)規(guī)定。3 試驗方法本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑和水，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和GB/T 6682中規(guī)定的三級水，所用試液中的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在沒有注明其他要求時均要求按GB/T 601 , GB/T 602制備。3.1 外觀的測定取樣品少許放入燒杯，下襯白紙進(jìn)行目測。3.2 粉酶水分的測定按GB/T 6435規(guī)定進(jìn)行檢測。3.3 粉酶粒度的測定按GB/T 5917規(guī)定進(jìn)行檢測。3.

3、4 粉酶熾灼殘渣的測定按中國獸藥典規(guī)定進(jìn)行檢測。3.5 衛(wèi)生指標(biāo)的測定按飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB13078和NY/T 722規(guī)定的方法進(jìn)行。3.6 溶菌酶酶活性 （效價） 的測定溶菌酶微生物測定法系在適宜條件下， 通過檢測溶菌酶對微生物的抑制作用， 計算出溶菌酶活性（效價）的方法。依據(jù)試驗設(shè)計原理不同，可分為比濁法和瓊脂擴散法（即管碟法）。3.6.1 試劑和溶液5.6.1.1 溶酶小球菌（ Micrococcus Lysodeiktidus ）將溶酶小球菌接種于固體培養(yǎng)基上，置37培養(yǎng)48 小時，用無菌水將菌體洗下，用紗布濾過，濾液離心后，傾去上層清液，用水洗滌菌體數(shù)次，然后用少量水懸浮，冰凍干燥，

4、得淡黃色粉末，供測定用，保存一年。使用時， 在營養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代培養(yǎng)，工作用菌種不超過 5 代， 斜面菌種從培養(yǎng)好到使用時間，最長不超過2 個月。并將培養(yǎng)好的斜面菌種，放置4冰箱保存。制備的菌懸液可以使用一周，不用時放置4冰箱保存。5.6.1.2 磷酸緩沖液稱取磷酸二氫鈉（）11.7g,磷酸氫二鈉（）7.86g ,加900mL水溶解，調(diào)pH值至，定容至1000mL。5.6.1.3 10氫氧化鈉溶液5.6.1.4 1硫酸銅溶液5.6.1.5 30%三氯醋酸5.6.1.6 斜面培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂5.6.1.7 抗生素檢定培養(yǎng)基II 號5.6.1.8 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品5.6.1.9 儀器5.6.2.

5、1 分析天平：精密度；5.6.2.2 牛津杯：牛津杯內(nèi)徑士0.1mm,外彳5+ 0.1mm,高士 0.1mm,每套牛津杯的重量差異不超過± 0.05g ，內(nèi)外壁及兩端面光滑平坦。管壁厚薄一致；5.6.2.3 陶瓦蓋：內(nèi)徑約 103mm外徑108mm,平坦，吸水性強。應(yīng)定期清洗、干燥或干熱滅菌；5.6.2.4 游標(biāo)卡尺：精度0.02mm；5.6.2.5 雙碟：內(nèi)徑約90mm外徑16mm- 17mm的硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟底厚薄均勻，水平透明，無色斑氣泡；5.6.2.6 超凈工作臺：有效工作面局部潔凈度100 級。用于試驗菌的接種傳代或菌懸液制備；5.6.2.7 pH酸度計：精確到；

6、5.6.2.8 分光光度計：配10mmb匕色皿，可在 450nm下測定吸光值；5.6.2.9 離心機：轉(zhuǎn)速為 4000r/min 以上;5.6.2.10 秒表：每小時誤差不超過5s；5.6.2.11 恒溫培養(yǎng)箱：設(shè)置漂移溫度為35c37C;5.6.2.12 高壓滅菌鍋5.6.2.13 烘箱5.6.2.14 其它玻璃器皿：刻度吸管：1 mL , 2mL 5mL, 10mL, 25mL無菌吸管等；5.6.2.15 試驗方法5.6.3.1 鑒別固體樣品：取本品10mg,溶于1mL水中，力口 30%三氯醋酸2滴，產(chǎn)生白色沉淀。取試管一支，加5%§菌酶水溶液2滴、10%M氧化鈉5滴及1%硫酸銅

7、溶液1滴，混勻后，應(yīng) 顯紫玫瑰色。5.6.3.2 方法一：比濁法特定濃度的溶酶小球菌懸浮液在450nm條件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球菌底物會引起吸光度降低，通過計算指定時間內(nèi)吸光度降低的幅度可以計算出溶菌酶的活力。試驗步驟：精確稱取樣品（液體樣品需在離心機上以3500r/min離心10min后取上清液）不少于 20mg,用的L磷酸緩沖液稀釋到酶活單位為100U/ mL200U/mL ,備用。將保存好的溶酶小球菌在營養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代兩次后的菌體37c培養(yǎng)48小時，再用生理鹽水從培養(yǎng)基上洗脫下來，并稀釋到一定倍數(shù)，使其在25c時，在450nm波長處測定的吸光度A為之間。精密取底物

8、懸浮液，放入比色杯中，在 450nm波長處測定其吸光度，作為零時讀數(shù)，然后取樣品溶液，加入比色杯中，用秒表開始計時，迅速混合，以磷酸緩沖液做空白，到60秒時記下吸光度A60. o 試樣酶活力的計算:1000Xd =%(A 0-A60) X NX 2(1)XdAoA60式（1）中:待測樣品的溶菌酶活力，U/g （或mL）0秒時的吸光度60秒時的吸光度M 一樣品質(zhì)量，g （或mL） LN樣品總的稀釋倍數(shù)5.6.3.3 方法二：管碟法利用溶菌酶的抗菌性質(zhì)及其溶液 在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，將未知效價的樣品液與已知效價的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 在同一條件下， 在攤布高度敏感性特定試驗菌的培養(yǎng)基上 進(jìn)行一定時間的對

9、照培養(yǎng) ，溶菌酶 溶液 在培養(yǎng)基內(nèi)的擴散到達(dá)適當(dāng)范圍內(nèi) 時就 產(chǎn)生了抑制試驗菌生長的透明抑菌圈，并且在一定的溶菌酶濃度范圍內(nèi)， 溶菌酶對數(shù)濃度與抑菌圈直徑成正比。 經(jīng)比較標(biāo)準(zhǔn)液與樣品兩者抑菌圈直徑或面積大小，采用二劑量法，即可推算出樣品的效價。 菌懸液的制備：將保存好的溶酶小球菌在營養(yǎng)瓊脂斜面上活化，傳代兩次后的菌體37培養(yǎng)48 小時，再用10mL 生理鹽水將一支培養(yǎng)好的溶酶小球菌斜面菌體洗下制成菌懸液，盡量保證每次所加指示菌的濃度一樣，供測定用。 測定平板的制備：底層：用滅菌破口移液管（25mL）,吸取已融化的培養(yǎng)基20mL注入雙碟內(nèi)，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋。菌層：取出溶酶小球菌菌懸液，按

10、1%勺菌量添加，吸取菌懸液加入已融化冷卻至50 c55c的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌10mL破口移液管，吸取菌層培養(yǎng)基5mL使均勻分布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺上，用陶瓦蓋覆蓋，放置40min ，待凝固，備用。 待測酶液的準(zhǔn)備：精確稱取樣品（液體樣品需在離心機上以 3500r/min 離心 10min 后取上清液）不少于20mg，用的 L 磷酸緩沖液稀釋到酶活單位在5000U/mL 左右，備用。 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的滴加：取 8 個雙碟，在每個雙碟中對稱放入 4 個牛津杯， 分別成對角滴加標(biāo)準(zhǔn)品高 （SH） 、 標(biāo)準(zhǔn)品低（SL）及樣品高（TH）、樣品低（TL）兩種濃度的溶液，直至牛津杯口平滿。注

11、意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴散時間對測定結(jié)果有影響。 （注意：標(biāo)準(zhǔn)品必須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能隔夜。從測定平板的制備到進(jìn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，整個過程必須在2 小時內(nèi)完成）。 雙碟的培養(yǎng)及抑菌圈的測量將雙碟置于37±0.5C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16小時18小時后，取出雙碟，測定抑菌圈直徑（如 有破圈或不完整的抑菌圈， 則應(yīng)舍棄該碟） 。 樣品的高低劑量透明圈直徑盡量和標(biāo)準(zhǔn)品的高低劑量透明圈直徑接近，整個系統(tǒng)的透明圈直徑控制在15mm- 19mm間。 結(jié)果判定：微生物測定結(jié)果的正確性和精密度受很多因素影響， 為了使測定結(jié)果更能真實的反映客觀情況， 符合設(shè)計原理， 就必須將測定結(jié)果按生物檢定統(tǒng)計， 進(jìn)行可靠性測驗及效價計算和可信限計 算。統(tǒng)計學(xué)分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計法進(jìn)行F 的顯著性測驗， 要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<）,偏離平行不應(yīng)顯著 （P>且可信限率不得超過5%將樣品的估計實驗結(jié)果在可靠性成立前提下，方可根據(jù)設(shè)計的計算公式進(jìn)行樣品效價計算。效價控制在實際效價的 90%110%,否則，需要重新估計效價進(jìn)行測定R log 1 乜一S2 S1 I 100%T2 S2 T1 S1Pt = R x At (3)式中:R