土壤中放線菌的分離與純化

1、土壤中放線菌得分離與純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握放線菌得生長(zhǎng)特性，微生物得培養(yǎng)方法。2掌握微生物實(shí)驗(yàn)得基本生物技術(shù)，主要包括無(wú)菌操作技術(shù)，純種 分離技術(shù)，純種培養(yǎng)技術(shù)，以及抗生素檢測(cè)等.3掌握合成培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基得制備方法.4學(xué)習(xí)對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)得中出現(xiàn)問(wèn)題得分析，解決方法實(shí)驗(yàn)材料藥品：可溶性淀粉、KNQ NaC l、K2Hp O 4?3H 2Q Mg S Q?7HQFeSO?7H2Q 瓊脂、重銘酸鉀其她：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、 三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無(wú)菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、 酒精棉球、鐐子、玻璃鉛筆。實(shí)驗(yàn)原理放線菌就是重要彳#抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中（主

2、要就是鏈 霉菌），其數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌.一般在中性偏堿性、有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性 好得土壤中含量較多.由于土壤中得微生物就是各種不同種類(lèi)微生物 得混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜得微生物 群體中分離出來(lái)，從而獲得某一菌株得純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋 倒平板法.根據(jù)放線菌得營(yíng)養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng) 基或有機(jī)氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（12 0C 熱處理1 h ）,或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴1 0 叫等），都可以使細(xì) 菌，霉菌出現(xiàn)得數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過(guò)稀釋法， 使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株.放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑

3、制其她菌種得生長(zhǎng)，故可用金黃色葡萄球菌（G+）與大腸桿菌（G-）作指示菌鑒別放線菌。高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基就是培養(yǎng)放線菌得培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基就是采用化學(xué)成分完全了解得純?cè)噭┡渲贫傻门囵B(yǎng)基，高氏一號(hào)培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KND3、NaCl、KzHPO?3 H2O、MgS 。4?7H 2O作為無(wú)機(jī)鹽，F(xiàn)eS。4? 7 H2O作為微生物得微量元素，提 供鐵離子等組成1、高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基得制備K2HPQ ?3H2 O 0。125g,可溶|i淀粉 5 g,硝酸鉀 0、25, Mg SO4?7H200.125g, FeSO477H20 0 0 25g,氯化鈉 0. 1 2 5 g ,瓊脂 5 g

4、,水 250 ml .配制時(shí),先依次加入上述藥品（除瓊脂外）順序溶解，加入無(wú)菌水至 250ml,調(diào)節(jié)pH=7、4,再加入瓊脂不斷攪拌震蕩至溶化后,12 1 C 滅菌2 0分鐘。將6套平皿、1 2只試管滅菌.2、土壤中放線菌得分離1。編號(hào)，分裝：取6套無(wú)菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋 液得稀釋度(1 o 3 1 o 4、10 5)。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。然后 在每皿中倒入已溶化并冷凝至 5 0c左右得高氏一號(hào)培養(yǎng)基1520m l左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml 一只盛有1 0 m l無(wú)菌水得試管，排列于試管架 上，依次標(biāo)明 10-1、102、103、104、10-5、10 6.2

5、.稀釋傾注分離稱(chēng)1 g 土樣放入10ml無(wú)菌水試管中振蕩10min,即10T得土壤懸 液，靜置30s。用無(wú)菌吸管無(wú)菌操作取10 1濃度得土壤懸液1 m 1并加入編號(hào)1 02得無(wú)菌試管中，并吹吸吸管23次，吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開(kāi)水面， 使其混合均勻。即為1 02濃度得土壤稀釋液。依此類(lèi)推，直到稀釋至 105得試管中(每個(gè)稀釋度換1支無(wú)菌吸管).如圖-17-4-5 -fl -1 -g 口10 IC 1U 10101010 io LCV3 .倒平板分離培養(yǎng)于上述盛有不同稀釋度菌液得培養(yǎng)皿中，倒入溶化后冷卻至4 5c 左右得高氏培養(yǎng)基約1 0 15ml,置水平位置，迅速旋動(dòng)混勻，待凝固 （若融化得培養(yǎng)

6、基溫度太高，會(huì)產(chǎn)生太多得冷凝水，影響觀察.）用1ml無(wú)菌吸管分別精確地吸取IO-、I。、I。,得稀釋 菌液1 m 1 ,對(duì)號(hào)放入編好號(hào)得無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對(duì)應(yīng)兩個(gè)平 板。用無(wú)菌涂布棒（從濃度小液開(kāi)始）將加入平板培養(yǎng)基上得土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻，涂完一個(gè)平板用酒精燈滅菌稀釋涂布平板法4培養(yǎng) 接種完畢，將平皿與試管放入28c恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要就是鏈霉菌）菌落。菌種純化1、倒平板將加熱融化得高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基倒平板，并標(biāo)號(hào).2、平板劃線劃線得方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目得都就是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋?zhuān)剐纬蓡蝹€(gè)菌落。常用得劃線方法有下列二種:圖V 3劃線分

7、離示意圖分區(qū)劃線用接將培養(yǎng)皿底部用姆指與無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài),在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi).在此同時(shí),用環(huán)狀接種針在火焰旁刮 取少許菌苔，在平板培養(yǎng)基得一邊，作第1次平行劃線67條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約7 0角，用燒過(guò)冷卻得接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第 2次平行劃線（圖V 3）,然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成3 0角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng) 皿邊緣,也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培 養(yǎng)。連續(xù)劃線將挑取有樣品得接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線（圖V 4,B）。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置28c培AB養(yǎng).V 4劃線分離示意圖拮抗實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)出菌落后，要判斷就是

8、否已分離到了純菌種.1配置鑒別培養(yǎng)基配置金黃色葡萄球菌與大腸桿菌培養(yǎng)基。2標(biāo)號(hào) 在兩平板上標(biāo)注均勻間隔得7個(gè)區(qū)域。2挑菌落在純培養(yǎng)得平板上切取生長(zhǎng)較好得放線菌落依次放入標(biāo)注區(qū)域中（在火焰旁切?。糜? 8c恒溫箱培養(yǎng)1天后可觀察到 有抑菌圈生成。討論1高氏培養(yǎng)基得配置關(guān)鍵就是pH值得調(diào)節(jié)與重銘酸鉀得加入. 放線菌得最適生長(zhǎng)條件就是233 7 ,pH7、07、5,而在同樣條 件下也利于霉菌生長(zhǎng)。在高溫殺菌下，放線菌與霉菌得抱子仍可以存 活,所以必須加入重銘酸鉀抑制霉菌與細(xì)菌得生長(zhǎng)（對(duì)放線菌無(wú)抑制 作用）。否則霉菌大量生長(zhǎng).如圖培養(yǎng)基配置時(shí)各成分得溶解順序應(yīng)就是先加緩沖化合物，后就是 主要元素、

9、次要元素.調(diào)節(jié)pH值時(shí)，加入酸堿要緩慢、少量、多加攪 拌，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿而破壞營(yíng)養(yǎng)成分.我們第一次配置得高氏培養(yǎng)基很可能就就是由于酸堿調(diào)節(jié)時(shí)酸堿過(guò)量與未加入重銘酸鉀而導(dǎo)致失敗。2 放線菌可以產(chǎn)生色素，且放線菌代表屬也分好幾種。其菌落一般為圓形，菌落質(zhì)地致密表面呈較緊密得絨狀或堅(jiān)實(shí)、 干燥、多皺, 地衣?tīng)?表面干燥?？勺鳛殍b別菌種得基本參考依據(jù)。抱子絲生長(zhǎng)到一定階段可形成抱子由于抱子含有不同色素，成熟 得抱子堆也表現(xiàn)出特定得顏色，而且在一定條件下比較穩(wěn)定 ，故也就 是鑒定菌種得依據(jù)之一。但抱子得形態(tài)與大小不能籠統(tǒng)地作為分類(lèi)鑒 定得重要依據(jù).3 整個(gè)過(guò)程要保證在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基及儀器可用高壓 蒸汽滅菌。接種時(shí)，實(shí)驗(yàn)桌要用9 5%導(dǎo)酒精擦拭，且在接種時(shí)要在火 焰區(qū)得無(wú)菌范圍內(nèi)（空氣中含有大量灰塵、細(xì)菌與霉菌抱子等造成污 染），且打開(kāi)培養(yǎng)基時(shí)間盡量短。4稀釋倒平板法時(shí)涂布要均勻，否則，細(xì)菌密度不均導(dǎo)致菌落生 長(zhǎng)過(guò)于集中，細(xì)菌無(wú)法充分利用營(yíng)養(yǎng)成分影響生長(zhǎng)， 且在鑒別時(shí)較難 瞧到明顯得抑菌圈。稀釋時(shí)除了應(yīng)用平板涂布外還用了劃線法。 涂布主要就是通過(guò)稀 釋溶液方法減少細(xì)菌分布密度，劃線法