人類免疫缺陷病毒抗體檢測(cè)ELISA-檢驗(yàn)科免疫室作業(yè)指導(dǎo)書

1、【實(shí)用】檢驗(yàn)科SOP文件人類免疫缺陷病毒抗體檢測(cè) ELISA原理在微孔條上預(yù)包被純化基因工程人類免疫缺陷病毒I型和II型（HIV-1HIV-2）抗原（合成肽或基因重組蛋白），采用雙抗原夾心法檢測(cè)血清或血漿中人類免疫缺陷病毒抗體。樣品加入包被抗原反應(yīng)孔，在隨后的溫育過(guò)程中，若樣品中含特異抗體，則該抗體與包被抗原形成抗原抗體復(fù)合物被吸附到固相，再加入酶標(biāo)記的HIV-1HIV-2抗原，最終形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合的游離 酶，加入顯色劑后顯色。標(biāo)本采集2.1 采集前病人準(zhǔn)備：受檢者應(yīng)空腹2.2 標(biāo)本種類：血清或血漿2.3 標(biāo)本要求：采集病人靜脈血 2ml （可用EDT砒凝），室溫

2、放置 不超過(guò)4小時(shí)，分離血清備用。標(biāo)本儲(chǔ)存：2-8 C保存不應(yīng)超過(guò)48小時(shí)，-20 C不應(yīng)超過(guò)3個(gè)月，-70 C長(zhǎng)期保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)輸：密封，室溫運(yùn)輸。標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)：污染、標(biāo)本量不足、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不宜作此項(xiàng)檢測(cè)。試齊I6.1 試劑名稱：人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒6.2 試劑生產(chǎn)廠家：珠海麗珠試劑有限公司。6.3 包裝規(guī)格：96Test/Kit6.4 試劑盒組成：包被反應(yīng)板，HIV酶標(biāo)記物，陽(yáng)性對(duì)照血清，陰 性對(duì)照血清，濃縮洗滌液，底物 A,底物B,終止液，封口膜，密封 袋。試劑儲(chǔ)存條件及有效期：2-8 C避光保存，有效期6個(gè)月。儀器設(shè)備儀器名稱：自動(dòng)酶標(biāo)儀儀器廠家：Ray

3、to儀器型號(hào)：RT-2100C操作步驟平衡：將試劑盒各組分取出，平衡至室溫（18-25 C）,微孔板開(kāi)封 后，余者及時(shí)以自封袋封存。配液：濃縮洗滌液配制前充分搖勻（如有晶體應(yīng)充分溶解），濃縮洗滌液和蒸儲(chǔ)水或去離子水按1:19稀釋后使用。編號(hào)：將微孔條固定于支架，按序編號(hào)。加樣：用加樣器在微孔反應(yīng)條板孔中加入樣品 50 l;空白孔不加任 何液體；陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔分別加入陰陽(yáng)對(duì)照各 50 l, 標(biāo)好位置。對(duì)照應(yīng)在所有標(biāo)本加完以后再加，以保證閾值準(zhǔn)確性。溫育（一）：充分混勻，加上封板膜，置 37c溫育30分鐘。洗滌（一）：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60 秒的浸泡時(shí)

4、間）。加酶：分別在每孔中加入酶標(biāo)記物 50 l,輕拍混勻。溫育（二）：充分混勻，加上封板膜，置 37c溫育30分鐘。洗滌（二）：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應(yīng)保持30-60 秒的浸泡時(shí)間）。8.10 顯色：每孔加入底物 A、B各50 1,輕拍混勻，置37c暗處 20分鐘。8.11 終止：每孔加終止液50 1,混勻。8.12 測(cè)定：用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng) 450nm或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)定各孔 OD值（用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)需設(shè)空白對(duì)照一孔，30分鐘內(nèi)完成測(cè)定，并 記錄結(jié)果）。結(jié)果判斷與分析臨界值（C.O.）的計(jì)算：臨界值=0.15+陰性對(duì)照平均OD值。結(jié)果判定：樣品OD值S/C.O=1者為陽(yáng)性

5、樣品OD值S/C.O1者為陰性正常時(shí)，陰性對(duì)照OD值應(yīng)=0.80,陰性對(duì)照若小于0.08以0.08計(jì)算。若陽(yáng)性對(duì)照OD值超出正常范圍或其孔間之差大于 30%,應(yīng)重復(fù)試 驗(yàn)。初次試驗(yàn)陽(yáng)性者應(yīng)重新取樣進(jìn)行雙孔復(fù)試，按全國(guó)HIV檢測(cè)管理規(guī)范的要求，須將血樣或重新采血送HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室做確認(rèn)試驗(yàn)，確認(rèn) 報(bào)告陰性者，血可以發(fā)放使用；凡確認(rèn)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性和可疑者，血不能發(fā) 放使用，統(tǒng)一送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室處理。質(zhì)量控制：每次測(cè)定均做雙孔或以上復(fù)試；陰陽(yáng)對(duì)照OD值應(yīng)在要求范圍內(nèi)。參考范圍：陰性12 .臨床意義：在血清中HIV抗體的存在表明可能有人類免疫缺陷 病毒感染。13 .操作性能：靈敏度、特異性高。14 .方法局限性

6、14.1 只能用作HIV抗體檢測(cè)的初篩試驗(yàn)。14.2 樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒(méi)有一定正相關(guān)。15 .病危報(bào)警值的處理：初次試驗(yàn)陽(yáng)性者應(yīng)重新取樣進(jìn)行雙孔復(fù)試， 按全國(guó)HIV檢測(cè)管理規(guī)范的要求，須將血樣或重新采血送HIV確認(rèn)實(shí) 驗(yàn)室做確認(rèn)試驗(yàn)；通知防?？坪团R床申請(qǐng)醫(yī)生。16 .注意事項(xiàng)16.1 試劑的使用：整個(gè)檢測(cè)工作必須符合全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作規(guī) 范中應(yīng)嚴(yán)格防止交叉感染，操作時(shí)必須帶手套，穿工作衣，嚴(yán)格健 全和執(zhí)行消毒隔離制度。所有樣品，洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染 物處理。16.2 HIV-/HIV-2抗體測(cè)定結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。16.3 樣品、酶結(jié)合物溶液等應(yīng)用加液器加注，

7、并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性。16.4 洗滌時(shí)各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗靜。16.5 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。16.6 微孔板條從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)在室溫中平衡至潮氣干盡方 可使用；未用完者須放入有干燥劑的密封袋中保存。16.7 用于檢測(cè)的樣品應(yīng)保持新鮮。16.8 剩余樣品及廢棄物應(yīng)經(jīng)121攝氏度高壓蒸汽滅菌30分鐘，或 用5.0g/l次氯酸鈉等消毒劑處理30分鐘后廢棄。16.9 不同批號(hào)的試劑組分不可混用。16.10 本試劑的使用單位必須是經(jīng)當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門批準(zhǔn)的HIV初篩實(shí)驗(yàn)室；使用人員必須是經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的指定人員。17 .當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)（儀器）不能工作時(shí)，所采取的補(bǔ)救措施：應(yīng)保證所有操作步驟正確無(wú)誤；可以比對(duì)陰陽(yáng)對(duì)照，肉眼判讀；無(wú)法準(zhǔn)確判 讀者，