T4DNA連接酶EL0011Thermoscientific

1、T4DNALigaseThermoscientific#EL0011產品信息特點快速-室溫下 10 分鐘內完成粘末端的連接反應。該酶在 Fermentas 公司限制酶、PCRRT 緩沖液(添加 ATP)中活性。配套提供聚乙二醇溶液以有效進行平末端連接。應用克隆酶切產生的DNA片段?？寺CR產物。連接雙鏈寡聚核甘酸街頭或連接物。定點誘變。擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)。連接酶介導的RNA檢測(3)。雙鏈DNA,RNA或DNA/RNA復合體中缺口的修復。線性DNA自身環(huán)化。說明T4?DNALigase 催化雙鏈 DNA 或 RNA 中毗鄰的 5-磷酸基團和 3-羥基末端之間形成磷酸二酯鍵。酶還可

2、以修復雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 復合體中的單鏈切口，連接 DNA的粘性和平末端，但是該酶對單鏈核酸無酶活性(1,2)。T4DNALigase 需要輔因子 ATP。濃度1Weissu/M=200CEU*/日5Weissu/M=1000CEU*/日30Weissu/M=6000CEU*/日*一個粘性末端連接單位的是指在 16C、30 分鐘內 50%連接 Hindlll 酶切的 lamdaDNA 產物所需要的酶的量。來源含有 T4 噬菌體克隆基因 30 的大腸桿菌。分子量55.3kDa,單體?；钚詥挝欢x1 個活性單位是指在 ATP-PPi 交換反應中，37C、20 分鐘內將 1nm

3、ol32PPi轉換為 Norit 可吸收形式所需的酶量(Weiss 單位*(4)。酶活性分析混合物：66mMTris-HCl(pH7.6),6.6mMMgCl2,0.066mMATP,10mMDTT,3.3?M32PPi.*1 個 Weiss 單位相當于約 200 個粘性末端連接單位。1 個粘性末端連接單位：20?日反應體系(50mMTris-HCl?(pH?7.5),10mM 埔 gCl2,10mM 領 TT,1mMATP,25聞/ml 燃 SA,0.12M(300?聞/ml)的 5-DNA 末端)中，在 16C、30 分鐘內 50%連接 HindIII 酶切的LambdaDNA 產物所需要

4、的酶量。保存緩沖液保存緩沖液組分：20mMTris-HCl(pH7.5),1mMDTT,50mMKCl,0.1mMEDTA 和 50%(v/v)甘油。10XT4DNALigase 緩沖液(#B69)400mMTris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT,5mMATP(pH7.8,25C)。質量控制相關測試表明無內切和外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。功能檢測：粘性末端或平末端 DNA 的連接能力。抑制與失活抑制劑：當反應體系中 NaCl 或 KCl 的濃度超過 200?mM 時，可強烈抑制 T4DNALigase 活性。失活：65C 加熱 10 分鐘或者 70C 加熱 5

5、 分鐘。備注聚乙二醇(PEG)極大地增加平末端連接效率(5)。反應體系中的 PEG4000 的建議濃度為 5%(w/v)。T4DNALigase 與 DNA 結合會改變條帶的瓊脂糖凝膠電泳遷移率。為避免此現(xiàn)象，電泳前需處理樣本或分子量標準。樣本處理方法如下：樣本或分子量標準與 Fermentas公司 6XDNALoadingDye&SDS 溶液(#R1151)混合； 70C 加熱 5 分鐘或 65C 加熱 10 分鐘后冰浴保存。轉化時，連接產物的體積不能超過感受態(tài)細胞體積的 10%。電轉化之前，先用氯仿抽提方法除去連接混合物中的 T4DNALigase。然后經乙醇沉淀純化抽提產物。操作

6、手冊DNA 插入片段與載體 DNA 連接1.反應體系配方如下：組分粘性末端連接平末端連接線性載體 DNA20-100ng插入片段 DNA與載體的摩爾比為 1:1 到 5:110XT4DNALigasebuffer2pl50%PEG4000 溶液*-2plT4DNALigase0.24(1u)1pl(5u)水，無核酸酶(#R0581)至 20M*50%PEG4000 溶液隨 FermentasT4DNALigase 配套提供(#EL0335,#EL0334)。2 .粘性末端：22C 孵育 10 分鐘；平末端：22C 孵育 1 小時。3 .65C 熱失活 10 分鐘。4.轉化：每 50J 化學感受

7、態(tài)細胞使用 5J 連接產物；每 50M 電轉感受態(tài)細胞使用 1-2M 連接產物備注:如需增加轉化子數(shù)量：如果連接產物的產量不夠，建議 4C 孵育連接過夜。采用氯仿抽提替換熱失活方法，平末端連接產物建議采用電轉化方法。線性 DNA 自身環(huán)化1.反應體系配方如下：線性載體 DNA10-50ng10XT4DNALigasebuffer5plT4DNALigase1pl(5u)水，無核酸酶(#R0581)至 50M總體積50pl2.充分混勻后短暫離心，22C 孵育 1 小時。3.65C 熱失活 10 分鐘。4.取大約 5M 連接產物轉化 504 化學感受態(tài)細胞。備注采用氯仿抽提替換熱失活方法，平末端連

8、接產物建議采用電轉化方法。接頭連接雙鏈寡核甘酸接頭常用于產生插入片段中沒有的兼容性突出末端。接頭含有限制酶識別位點，與目標片段連接后酶切可產生與克隆載體匹配的粘性末端。此外接頭也可直接帶有匹配的粘性末端，與克隆載體直接連接，無需額外操作。1 .根據(jù)應用不同，準備下列的反應體系：組分連接，用于后續(xù)酶切僅僅連接線性 DNA5gl(100-500ng)磷酸化接頭 51(1-210XT4DNALigasebuffer-2pl限制酶用 10Xbuffer21-ATP,10mM*1M(終濃度 0.5mM)-總體積20gl20gl50%PEG4000 溶液*21T4DNALigase(#EL0334)或(#

9、EL0335)0.4M 或 2M(2u)水，無核酸酶(#R0581)至 20gl總體積至 201至 20M1 混合 10pl100mMATP 溶液(#R0441)和 90M 水(無核酸酶，#R0581)制備 10mMATP 溶液2 *50%PEG4000 溶液隨 FermentasT4DNALigase 配套提供(#EL0335,#EL0334)。2,充分混勻后短暫離心，22C 孵育 1 小時。3.65C 熱失活 10 分鐘。備注連接產物酶切前無需純化，可將限制酶直接加入連接反應混合物中。T4DNALigase 活性分析對照反應連接酶失活或樣本 DNA 中的雜質會導致連接失敗。推薦采用對照 D

10、NA(如：LambdaDNA/HindIIIDNAMarker(#SM0101)的連接實驗分析 T4DNAligase 的活性。1,對照連接混合物準備：LambdaDNA/HindIIIDNAMarker(#SM0101)1pl(0,5聞)10XT4DNALigaseBuffer2plT4DNALigase1u水，無核酸酶(#R0581)至 20M總體積至 20M2,充分混勻后短暫離心，22C 孵育 10 分鐘3,制備上樣混合物：連接產物10pl6XDNALoadingDye&SDSSolution21圖 1,對照實當評價 T4DNALigase 活性。1-LambdaDNA/Hind

11、IIIfragments,未連接2 連接后的 LambdaDNA/HindIII結果解釋出現(xiàn)更高分子量條帶且低分子量條帶變弱，表明連接酶有活性。連接后條帶不發(fā)生變化，說明連接酶失活。參考文獻：|Rossi,R.,etal.,FunctionalcharacterizationoftheT4DNALigase:anewinsightintothemechanismofaction,NucleicAcidsRes.,25,2106-2113,1997.、Cherepanov,A.V.,etal.,BindingofnucleotidesbyT4DNALigaseandT4RNALigase:opticalabsorbanceandfluorescencestudies,Biophys.J.,81,3545-3559,2001.；Nilsson,M.,etal.,RNA-templatedDNAligationfortranscriptanalysis,NucleicAcidsRes.,29,578-581,2001.4Weiss,B.,etal.,Enzymaticbreakageandjoiningofdeoxyribonucleicacid,J.Biol.Chem.,243,4543-4555,1968.、Pheiff