器官移植和HLA配型

1、臨床免疫學檢驗臨床免疫學檢驗吉林醫(yī)藥學院檢驗學院吉林醫(yī)藥學院檢驗學院 器官移植與器官移植與HLAHLA分型檢測技術分型檢測技術major histocompatibility complex,major histocompatibility complex, MHCMHC主要組織相容性復合體主要組織相容性復合體人類白細胞抗原人類白細胞抗原h(huán)uman leukocyte antigen,human leukocyte antigen, HLA HLA/ HLA/ HLA復合體復合體/ / MHCMHC分子分子 / / MHCMHC抗原抗原 HLA HLA的的結構結構HLA-HLA-類分子類分子H

2、LA-HLA-類分子類分子第第1 1節(jié)節(jié) MHCMHC基因和遺傳特點（復習）基因和遺傳特點（復習）MHC基因的構成基因的構成MHC基因的特性基因的特性MHC基因的意義基因的意義一、一、MHCMHC基因的構成基因的構成（一）定位（一）定位 第第6號染色體短臂（號染色體短臂（6p21.31） 全長全長3600kb，共有，共有224個基因座位，個基因座位，128個表達產(chǎn)物。個表達產(chǎn)物。（二）基因區(qū)（二）基因區(qū) 經(jīng)典經(jīng)典類基因：類基因：B、C、A位點位點 經(jīng)典經(jīng)典類基因類基因 ：DP、DQ、DR位點位點類基因區(qū)類基因區(qū)HLA復合體復合體3600kb長度長度224基因座位基因座位類基因區(qū)類基因區(qū)ACBD

3、RDQDP著絲點著絲點Pq人人6 6號染色體號染色體MHC-類分子類分子MHC-類分子類分子DPDQDRBCA二、二、MHCMHC基因遺傳特點基因遺傳特點（一）（一）HLA為高度多態(tài)性基因為高度多態(tài)性基因 MHC基因復合體是由多個位置相基因復合體是由多個位置相鄰的基因座位組成，可以編碼相同或相鄰的基因座位組成，可以編碼相同或相似的似的MHC抗原?？乖HC為共顯性表達為共顯性表達類基因類基因類基因類基因DPDQDRBCA24249 96 6282810106262抗原特異性抗原特異性5595593 3818124241261262323506506276276851851等位基因數(shù)等位基因數(shù)

4、DRBDRBDRADRADQBDQBDQADQADPBDPBDPADPAA AC CB B類基因類基因類基因類基因基因型別基因型別24249 96 6282810106262抗原特異性抗原特異性5595593 3818124241261262323506506276276851851等位基因數(shù)等位基因數(shù)DRBDRBDRADRADQBDQBDQADQADPBDPBDPADPAA AC CB B類基因類基因類基因類基因基因型別基因型別人群之中所有基因座位等位基因都相同的幾率：人群之中所有基因座位等位基因都相同的幾率： 126 23 81 24 559 3 851 276 5061 1019 人群之

5、中人群之中MHCMHC抗原相同的幾率：抗原相同的幾率： 6 9 24 62 10 281 109 （二）單體型和連鎖不平衡性（二）單體型和連鎖不平衡性意義：器官移植選擇供體順序意義：器官移植選擇供體順序自身自身同卵雙生兄弟姐妹父母親屬無關人群同卵雙生兄弟姐妹父母親屬無關人群父母與子女父母與子女完全相同完全相同的幾率：的幾率：父母與子女父母與子女一半相同一半相同的幾率：的幾率：子女間子女間完全相同完全相同的幾率：的幾率：子女間子女間一半相同一半相同的幾率：的幾率：子女間子女間完全不同完全不同的幾率：的幾率： 0 0100%100% 25% 25% 50% 50% 25% 25%1.1.單體型遺傳

6、單體型遺傳1.1.單體型遺傳單體型遺傳（二）單體型和連鎖不平衡性（二）單體型和連鎖不平衡性2.2.連鎖不平衡性連鎖不平衡性（一）（一）HLAHLA為高度多態(tài)性基因為高度多態(tài)性基因第第2 2節(jié)節(jié) HLAHLA與器官移植與器官移植 在三類在三類HLAHLA分子中，分子中，、類分子是觸類分子是觸發(fā)移植排斥反應的首要抗原發(fā)移植排斥反應的首要抗原。次要組織相容性抗原次要組織相容性抗原ABOABO血型抗原系統(tǒng)血型抗原系統(tǒng)其他組織特異性抗原其他組織特異性抗原主要組織相容性抗原主要組織相容性抗原 決定移植決定移植“成敗成敗”的抗原的抗原 一、器官移植的類型一、器官移植的類型 （1 1）自體移植自體移植（aut

7、ograftautograft） 皮膚，骨髓，軟骨和骨皮膚，骨髓，軟骨和骨（2 2）同種同基因移植同種同基因移植（syngraftsyngraft） （3 3）同種異基因移植同種異基因移植（allograftallograft） 同種異型移植同種異型移植（4 4）異種移植（）異種移植（xenograftxenograft）一、同種異型排斥反應的識別機制一、同種異型排斥反應的識別機制受者對受者對T T細胞對供者的細胞對供者的MHCMHC分子的直接與間分子的直接與間接識別。接識別。（一）直接識別機制：（一）直接識別機制：受者受者T T細胞直接識別的靶結構細胞直接識別的靶結構 同種異型抗原的直接識別

8、及其效應同種異型抗原的直接識別及其效應 （二）間接識別（二）間接識別受者受者T T細胞識別受者細胞識別受者APCAPC加工處理的供加工處理的供者的者的MHCMHC分子分子在急性排斥反應中、晚期以及慢性排在急性排斥反應中、晚期以及慢性排斥反應中起重要作用。斥反應中起重要作用。 同種異型抗原的間接識別同種異型抗原的間接識別 二、二、 同種異型移植排斥反應的類型同種異型移植排斥反應的類型及效應機制及效應機制（一）宿主抗移植物反應一）宿主抗移植物反應（host versus graft reaction,HVGRhost versus graft reaction,HVGR）依據(jù)反應發(fā)生的時間及病理強

9、度分為：依據(jù)反應發(fā)生的時間及病理強度分為：1 1、超急性排斥反應（術后開始至幾個小時）、超急性排斥反應（術后開始至幾個小時）2 2、急性排斥反應（術后幾天至幾周）、急性排斥反應（術后幾天至幾周）3 3、慢性排斥反應（術后數(shù)月至數(shù)年）、慢性排斥反應（術后數(shù)月至數(shù)年） 超急性排斥反應發(fā)生示意圖超急性排斥反應發(fā)生示意圖 （二）移植物抗宿主反應（二）移植物抗宿主反應（ graftgraft versus host reaction,GVHRversus host reaction,GVHR ）更為嚴重的一種排斥反應更為嚴重的一種排斥反應原因：原因： （1 1）受者與供者）受者與供者HLAHLA不相匹配

10、；不相匹配； （2 2）移植物中成熟的）移植物中成熟的T T細胞多；細胞多； （3 3）受者處于免疫功能極度低下的狀態(tài)）受者處于免疫功能極度低下的狀態(tài)常見于：骨髓移植（造血干細胞移植）、胸常見于：骨髓移植（造血干細胞移植）、胸腺、脾移植及新生兒接受大量輸血。腺、脾移植及新生兒接受大量輸血。三、同種異體移植排斥反應的防治三、同種異體移植排斥反應的防治（一）尋求與受者（一）尋求與受者MHCMHC相配的供者組織或器官相配的供者組織或器官 是目前最為有效多見的方法。是目前最為有效多見的方法。1 1、ABOABO血型抗原配型血型抗原配型 2 2、HLAHLA抗原配型抗原配型供者與受者供者與受者HLA-A

11、HLA-A、B B相配的位點越多存活率相配的位點越多存活率越高；越高； 上述的基礎上，上述的基礎上，HLA-DRHLA-DR、DQDQ盡可能的匹配；盡可能的匹配； HLA-DRHLA-DR類型對存活率影響較大。類型對存活率影響較大。（二）使用免疫抑制藥物（二）使用免疫抑制藥物 1 1、多為抑制、多為抑制T T細胞藥物細胞藥物 環(huán)孢菌素環(huán)孢菌素A A（CsACsA），）， FK-506FK-506、RapamycinRapamycin 2 2、去氧精胍菌素等抗生素類；阻斷、去氧精胍菌素等抗生素類；阻斷T T細胞的生細胞的生長周期長周期 3 3、激素、激素 4 4、可溶性、可溶性CKCK受體、抗受

12、體、抗CKCK抗體和抗粘附分子抗體抗體和抗粘附分子抗體 阻斷協(xié)同刺激信號誘導阻斷協(xié)同刺激信號誘導T T細胞失能細胞失能 （三）誘導對移植抗原的特異性耐受三）誘導對移植抗原的特異性耐受 免疫抑制劑的毒副作用（致死性感染和免疫抑制劑的毒副作用（致死性感染和腫瘤）腫瘤） 理想方法是誘導特異性耐受。新方案：理想方法是誘導特異性耐受。新方案：誘導凋亡；誘導凋亡；誘導誘導T T細胞無應答（細胞無應答（anergyanergy）包括輸入）包括輸入可溶性可溶性CTLA-4CTLA-4及及CD40L-CD40CD40L-CD40、CD2-CD58CD2-CD58等等信息傳遞阻斷。信息傳遞阻斷。第第3 3節(jié)節(jié) H

13、LAHLA分型檢測技術分型檢測技術分子生物學分型分子生物學分型血清學分型技術血清學分型技術細胞分型技術細胞分型技術2020世紀世紀60 60 年代年代2020世紀世紀80 80 年代年代2020世紀世紀70 70 年代年代一、血清學分型技術一、血清學分型技術1.1.原理原理 應用一系列已知應用一系列已知HLAHLA特異性的特異性的分分型血清型血清與待測的淋巴細胞反應，通過與待測的淋巴細胞反應，通過補體依賴的細胞毒性實驗，來檢測補體依賴的細胞毒性實驗，來檢測HLAHLA抗原特異性?？乖禺愋浴５湫图夹g：定型板法（微量細胞毒實驗）反應結果測定1.1.染料拒染法染料拒染法臺盼藍臺盼藍伊紅伊紅碘化丙啶

14、碘化丙啶7-AAD7-AAD2.2.流式細胞術流式細胞術死（著染）細胞（死（著染）細胞（% %）記分記分結果判斷結果判斷0 010101 1陰性陰性111120202 2可疑陰性可疑陰性212150504 4弱陽性弱陽性515180806 6陽性陽性80808 8強陽性強陽性0 0未試驗或不能讀數(shù)未試驗或不能讀數(shù)染料拒染法的判定標準染料拒染法的判定標準2.2.血清學分型可檢測的抗原血清學分型可檢測的抗原 （SD SD 抗原）抗原）HLA-HLA-類分子類分子: :HLA-HLA-類分子類分子: : B, C , ADR, DQ （B細胞為靶細胞）3.3.方法學評價方法學評價操作簡便易行操作簡便

15、易行節(jié)約試劑、結果可靠、重復性好節(jié)約試劑、結果可靠、重復性好 無需特殊設備無需特殊設備耗時長耗時長不同批號抗血清結果常有不同不同批號抗血清結果常有不同優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點二、細胞學分型技術（二、細胞學分型技術（LD LD 抗原）抗原）1.1.原理原理混合淋巴細胞培養(yǎng)，檢測細胞增殖混合淋巴細胞培養(yǎng)，檢測細胞增殖（mixed lymphocyte culture,MLCmixed lymphocyte culture,MLC）單向單向MLCMLC雙向雙向MLCMLC陰性分型法陰性分型法 陽性分型法陽性分型法 1. 單向單向MLC刺激細胞：已知刺激細胞：已知HLAHLA型別的分型細胞型別的分型細胞 （預

16、處理，使其失去增殖能力預處理，使其失去增殖能力）反應細胞：受檢者外周血單個核細胞反應細胞：受檢者外周血單個核細胞 （具有增殖能力）（具有增殖能力）淋巴細胞轉化（形態(tài)學）淋巴細胞轉化（形態(tài)學）3 3H-TdR H-TdR 摻入法摻入法MTTMTT還原法還原法（1 1）陰性分型法）陰性分型法 刺激細胞刺激細胞 HLA-DP1受者受者T T淋巴細胞淋巴細胞 +增殖弱增殖弱HLA-DP1HLA-DP1非非HLA-DP1HLA-DP1 增殖強增殖強 純合子細胞純合子細胞只表達只表達HLA-DP1HLA-DP1 照射處理照射處理（2 2）陽性分型法）陽性分型法 預致預致T T敏細胞敏細胞 非非HLA-DP

17、1待測待測B B淋巴細胞淋巴細胞 +增殖弱增殖弱非非HLA-DP1HLA-DP1HLA-DP1HLA-DP1 增殖強增殖強 刺激細胞刺激細胞 HLA-DP1HLA-DP1 除除DP抗原外，其他抗原外，其他 HLA 抗原相同抗原相同照射處理照射處理2. 雙向雙向MLC 遺傳型不同的兩個個體淋巴細胞在體外混合遺傳型不同的兩個個體淋巴細胞在體外混合培養(yǎng)時，由于兩者培養(yǎng)時，由于兩者HLAHLA不同，能相互刺激導致對不同，能相互刺激導致對方淋巴細胞增殖，故稱雙向方淋巴細胞增殖，故稱雙向MLCMLC。方法學評價方法學評價： 不能分型，但可全面地反應供不能分型，但可全面地反應供- -受雙方組織受雙方組織相容

18、性。相容性。三、分子生物學分型技術三、分子生物學分型技術( (一）基本技術一）基本技術1.1.限制性片斷長度多態(tài)性限制性片斷長度多態(tài)性分析分析（restriction fragment length polymorphism,restriction fragment length polymorphism, RFLPRFLP）2.PCR/SSP2.PCR/SSP3.PCR-SSCP3.PCR-SSCP分型法分型法4.4.序列特異性寡核苷酸序列特異性寡核苷酸- -聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應（PCR-sequence specific oligonucleotide,PCR-sequence spe

19、cific oligonucleotide, PCR-SSO PCR-SSO）5.5.基于序列的基于序列的HLAHLA分型法分型法（sequence-based HLA typing,SBTsequence-based HLA typing,SBT） 芯片技術芯片技術原理原理：PCR-SSOPCR-SSO反向斑點或印漬法的微型化。反向斑點或印漬法的微型化。( (二）集成技術二）集成技術（三）（三）PCR-SSCPPCR-SSCP分型法分型法原理：原理：對對ssDNAssDNA進行無變性劑的聚丙烯酰凝膠電泳，序進行無變性劑的聚丙烯酰凝膠電泳，序列的差異可形成不同的空間構象而導致電泳遷移率的差異，

20、列的差異可形成不同的空間構象而導致電泳遷移率的差異，如此可分辨出單一堿基的差異和檢測出如此可分辨出單一堿基的差異和檢測出DNADNA多態(tài)性或點突多態(tài)性或點突變。變。（單鏈非變性電泳遷移分析）（單鏈非變性電泳遷移分析）病例介紹病例介紹一例鏈球群感染后腎炎、腎衰竭后腎臟移植。一例鏈球群感染后腎炎、腎衰竭后腎臟移植。男，男，1414歲。首診前歲。首診前3 3個月，感冒發(fā)燒病史。個月，感冒發(fā)燒病史。首次就診原因首次就診原因: :頭痛，乏力，眼瞼浮腫。實驗室檢頭痛，乏力，眼瞼浮腫。實驗室檢查：蛋白尿，尿紅細胞陽性?？寡装Y治療查：蛋白尿，尿紅細胞陽性。抗炎癥治療1 1周，稍好，周，稍好，恢復上學，正常飲食

21、。恢復上學，正常飲食。2 2月后，惡心、乏力，眼瞼浮腫加重，月后，惡心、乏力，眼瞼浮腫加重，2424小時尿量小時尿量減少，蛋白管型。減少，蛋白管型。住院治療住院治療2 2個月，腎臟衰竭加重，每周透析個月，腎臟衰竭加重，每周透析3 3到到4 4次。次?；顧z見腎小球內活檢見腎小球內CICCIC沉淀，抗人沉淀，抗人IgAIgA、IgGIgG陽性。陽性。建議：申請腎移植手術。親屬自愿做建議：申請腎移植手術。親屬自愿做HLAHLA配型，同配型，同時申請自無關人群尋找供體腎。時申請自無關人群尋找供體腎。半年后分配到合適供體腎（無關人群）；檢查身半年后分配到合適供體腎（無關人群）；檢查身體，符合手術要求，進

22、行腎臟移植手術。體，符合手術要求，進行腎臟移植手術。術后臨床觀察并服用移植排斥抑制藥物，補充術后臨床觀察并服用移植排斥抑制藥物，補充EPOEPO。定期到醫(yī)院檢測血藥濃度，檢測免疫功能。定期到醫(yī)院檢測血藥濃度，檢測免疫功能。（移植后（移植后8 8年后生存狀態(tài)良好，但長期服用抗移植排年后生存狀態(tài)良好，但長期服用抗移植排斥藥物。斥藥物。病例介紹病例介紹一例鏈球群感染后腎炎、腎衰竭后腎臟移植。一例鏈球群感染后腎炎、腎衰竭后腎臟移植。腎臟移植前選擇供者的檢查項目：腎臟移植前選擇供者的檢查項目： 傳染性疾病病原學檢查傳染性疾病病原學檢查 ABOABO血型配型血型配型 HLAHLA配型符合要求配型符合要求 供受雙方淋巴細胞混合培養(yǎng)陰性供受雙方淋巴細胞混合培養(yǎng)陰性腎源選擇的原則腎源選擇的原則： 以以ABOABO血型完全相同者為好，選擇最佳血型完全相同者為好，選擇最佳HLAHLA配型的配型的供者器官，供者無傳染性疾病。供者器官，供者無傳染性疾病。移植后的臨床觀測移植后的臨床觀測: :1.1.T T細胞總數(shù)、細胞總數(shù)、CD4/CD8CD4/CD8比值、比值、IL-2IL-2及其受體的檢測，及其受體的檢測，判斷排斥反應的發(fā)生和評估免疫抑制劑治療效果；判斷排斥反