大腸埃希菌檢查法

1、大腸埃希菌檢查法 Escherichia Coli Test Method1.目的建立大腸埃希菌檢查法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。2.范圍適用于大腸埃希菌檢查的操作。3.責(zé)任者QC化驗(yàn)員。4.程序：4.1.簡(jiǎn)述4.1.1. 大腸埃希菌(Escherichia coli)即大腸埃希菌，為腸埃希菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希氏菌等5個(gè)種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服

2、藥品必須檢查大腸埃希菌。4.1.2. 用4-甲基傘形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide，MUG)和靛基質(zhì)(Indole)試驗(yàn)檢查大腸埃希菌是一項(xiàng)新技術(shù)，其檢驗(yàn)步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG-蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個(gè)菌，如MUG、Indole試驗(yàn)為陽(yáng)性或陰性即可報(bào)告結(jié)果。4.1.3. 原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系統(tǒng)來(lái)鑒定目標(biāo)菌。實(shí)驗(yàn)證明，96的大腸埃希菌含-葡糖苷酸酶(-glucuronidase，GUD)，約10的沙門菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒

3、光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬(wàn)倍，易于觀察，沒(méi)有主觀性，因而用MUG鑒定大腸埃希菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測(cè)。單一的MUG鑒別大腸埃希菌其漏檢率達(dá)6，鑒于98的大腸埃希菌其靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性，故將MUG與靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)合，比單用MUG可提高大腸埃希菌的檢出率。如MUG與Indole試驗(yàn)的反應(yīng)不一致時(shí)，則需將供試液的增菌培養(yǎng)物用EMB瓊脂平板分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗(yàn)鑒別。該法理論上可使大腸埃希菌的檢出率達(dá)98。如僅用IMViC生化試驗(yàn)來(lái)鑒別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌，其結(jié)果是含混的。4.2.儀器、設(shè)備及用具4.2.1. 無(wú)菌室4.2.2. 凈化工作臺(tái)4.2.3. 培養(yǎng)箱(

4、36±1)4.2.4. 高壓蒸汽滅菌器4.2.5. 顯微鏡(1500X)4.2.6. 微波爐4.2.7. 恒溫水?。?5±1）4.2.8. 離心機(jī)(5004000r/min)4.2.9. 0.45m±0.02m薄膜及過(guò)濾器4.2.10. 電冰箱4.2.11. 勻漿儀4.2.12. 366nm紫外燈4.2.13. 玻璃器皿、器具4.3.試液、指示液4.3.1. 0.9無(wú)菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水使溶解成1000ml，121滅菌20分鐘。4.3.2. 靛基質(zhì)試液 取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25

5、ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免聚熱導(dǎo)致溶液色澤變深，或取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。4.3.3. 甲基紅指示液 取甲基紅0.1g，加95乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。4.3.4. V-P試液 -萘酚乙醇試液：取萘酚6.0g，加無(wú)水乙醇溶解使成100ml。氫氧化鉀試液：取氫氧化鉀40.0g、加水使溶解成100ml。4.3.5. 革蘭染色液4.3.5.1. 結(jié)晶紫染液 取結(jié)晶紫1.0g、95乙醇20ml、1草酸銨(NH4)2C2O4溶液80ml。將結(jié)晶紫溶于乙醇后，與草酸銨混合，靜置48h，置密閉棕色瓶，可存放

6、數(shù)月。4.3.5.2. 革蘭碘液 碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300ml。用少量水溶碘化鉀，再加碘，待全溶后，加蒸餾水至30ml，置棕色瓶備用。4.3.5.3. 脫色液 95乙醇4.3.5.4. 沙黃(番紅)染液 沙黃(SafranineO)0.25g、95乙醇10ml、蒸餾水適量，將沙黃加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。4.3.6. 亞甲藍(lán)指示液 取亞甲藍(lán)0.5g，加水溶解使成100ml。4.3.7. 溴麝香草酚藍(lán)指示液 取溴麝香草酚藍(lán)0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水稀釋至100ml。變色范圍pH6.07.6(黃紅)4.3.8. 酸性品紅指示液 取

7、酸性品紅0.5g，加水100ml溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴需將溶液充分搖勻后再加第二滴，直至溶液呈草黃色；于沸水中保持15分鐘，靜置2小時(shí)，濾過(guò)，即得。變色范圍pH6.07.4(黃紅)。4.3.9. 曙紅鈉指示液 取曙紅鈉2.0g，加水溶解使成100ml。4.3.10. 無(wú)菌聚山梨酯80-氯化鈉溶液 取聚山梨酯80 1ml加0.9氯化鈉溶液使成100ml，121滅菌20分鐘。 4.3.11. 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2) 取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml，121滅菌20分鐘。4.3.12. 無(wú)菌對(duì)氨基苯甲酸試液 取對(duì)氨基苯甲酸0

8、.1g，加入含10ml水的具塞試管中，121滅菌20分鐘。4.3.13. 中性紅指示液 取中性紅1.0g，研細(xì)，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍Ph6.88.0（紅黃）。4.3.14. 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH7.0) 取磷酸二氫鉀3.56g，磷酸氫二鈉7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加熱使溶解，過(guò)濾。分裝，滅菌。4.4.培養(yǎng)基 4.4.1. 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基胨 10g 氯化鈉 5.0g牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml取上述成份混合，微溫溶解，調(diào)解pH為弱堿性，煮沸，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。4.

9、4.2. 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 胨 10g 氯化鈉 5.0g牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml瓊脂 14.0g取上述成份混合，微溫溶解，調(diào)解pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。4.4.3. 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）胨20.0g磷酸二氫鉀1.3g乳糖5.0g牛膽鹽2.0g氯化鈉5.0g（或去氧膽酸鈉）(0.5g)磷酸氫二鉀4.0g水1000ml除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4±0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。4.4.4. 4-甲基傘形酮葡萄糖化酶苷酸（4-met

10、hylumbellifery1-D-glu-curonide,MUG）培養(yǎng)基胨10.0g磷酸二氫鉀（無(wú)水）0.9g硫酸錳0.5mg磷酸氫二鈉（無(wú)水）6.2g硫酸鋅0.5mg亞硫酸鈉40mg硫酸鎂0.1g去氧膽酸鈉1.0g氯化鈉5.0gMUG75mg氯化鈣50mg水1000ml除MUG外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分裝5ml，滅菌。4.4.5. 曙紅亞甲基藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml曙紅鈉指示液2ml20%乳糖溶液5ml亞甲藍(lán)指示液1.3-1.6ml取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60，按無(wú)菌操作加入滅菌的

11、其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。4.4.6. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）胨20.0g1%中性紅指示液3ml乳糖10.0g瓊脂14.0g牛膽鹽5.0g水1000ml氯化鈉5.0g除乳糖1%中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60，傾注平皿。4.4.7. 蛋白胨水培養(yǎng)基胰蛋白胨 10g 氯化鈉 5g水 1000ml取上述成分混合，加熱溶化，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管，滅菌。4.4.8. 磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基胨 7g 磷酸氫二鉀（K2HP

12、O4） 2g葡萄糖 5g 水 1000ml取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管，滅菌。4.4.9. 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉 5g 枸櫞酸鈉（無(wú)水） 2g硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 0.2g 溴麝香草酚藍(lán)指示液 20ml磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1g 瓊脂 14g硫酸二氫銨（NH4H2PO4） 1g 水 1000ml除指示液和瓊脂外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為6.9±0.1，加入瓊脂，加熱溶化，加入指示液，混勻。分裝于小試管，滅菌，制成斜面。注：所用瓊脂應(yīng)不含游離糖，用前用水浸泡沖洗。4.4.10. 乳糖培養(yǎng)

13、基胨 20.0g 乳糖 10.0g0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水 1000ml除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.2±0.2，加入指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管3ml。滅菌。5%乳糖培養(yǎng)基胨 0.2g 溴麝香草酚藍(lán)指示液 6ml氯化鈉 0.2g 乳糖 5g磷酸氫二鈉 0.2g 水 100ml除乳糖和指示液外，混合各成分，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.4，加入乳糖/指示液，混合，分裝于含小倒管的滅菌小試管中，115滅菌15min。4.5.對(duì)照用菌液 取大腸埃希菌CMCC(B)44102的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營(yíng)養(yǎng)

14、肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1培養(yǎng)1824小時(shí)，取均勻培養(yǎng)物1 ml用0.9滅菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對(duì)照試驗(yàn)的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。4.6.準(zhǔn)備4.6.1. 檢驗(yàn)量4.6.1.1. 每批供試品檢驗(yàn)量，一般為10g或10ml，特殊貴重或微量包裝的供試品檢驗(yàn)量可以酌減。4.6.1.2. 供試品均須取自2個(gè)以上的包裝單位。4.6.2. 供試液的制備4.6.2.1. 液體供試品 取供試品10ml，加無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH7.0)至100ml，混勻，作為供試液。4.6.2.2. 固體、半固體或黏稠液供試品 取供試品10g

15、，加無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH7.0) 至100ml，用勻漿儀（30005000r/min、24min）或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。4.6.2.3. 非水溶性供試品 方法1 取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過(guò)45）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻璃棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20的供試液。方法2 取供試品10g，加至含20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯（制法見無(wú)菌檢查法中供試

16、品的無(wú)菌檢查項(xiàng)下）和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5-10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1：10的供試液。以上供試品如吸水膨脹，或粘度過(guò)高，可增加稀釋劑的量，制成1：201：100供試液。4.6.2.4. 含抑菌成分供試品供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌，不能檢出時(shí)，表明供試品有抑菌活性。該供試液按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。稀釋法 取規(guī)定量的供試液接種到較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。離心沉法

17、 取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。薄膜過(guò)濾法 取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑為47mm、孔徑不大于0.45±0.02m微孔濾膜的薄膜過(guò)濾器內(nèi)，過(guò)濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml，將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中。中和法 取規(guī)定量含磺胺類的供試品，于100ml增菌液(含1對(duì)氨基苯甲酸約15ml)中，含砷、汞類的供試品，于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中；含洗必泰供試品，于含適量聚山梨酯80等表面活性劑的100ml增菌液中(表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試，用量過(guò)大有抑菌作用)。沉降法 取規(guī)定量供試液，

18、自然沉降5min，取上層液于100ml增菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。4.7.檢查方法驗(yàn)證在建立供試品的大腸埃希菌檢查法或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，應(yīng)對(duì)供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和大腸埃希菌檢查法所規(guī)定的方法進(jìn)行。4.7.1. 驗(yàn)證方法4.7.1.1. 試驗(yàn)組 取規(guī)定量供試液及10-100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接種到增菌培養(yǎng)基中。4.7.1.2. 陰性菌對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照組

19、是為了驗(yàn)證大腸埃希菌檢查法的專屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。4.7.2. 結(jié)果判斷 陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和大腸埃希菌檢查法進(jìn)行供試品的大腸埃希菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的大腸埃希菌檢查同時(shí)進(jìn)行。4.8.操作步驟4.8.1. 檢驗(yàn)程序4.8.1.1. 陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn) 各供試品進(jìn)行大腸埃希菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10-100cf

20、u，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的大腸埃希菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢查出大腸埃希菌。已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，在該供試品檢查時(shí)不必再做陽(yáng)性對(duì)照。4.8.1.2.陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋劑10ml加入100ml（或200ml）大腸埃希菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。4.8.2. 增菌培養(yǎng) 4.8.2.1. 取膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基2份，每份各100ml。1份加入10ml供試液(相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2)，另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)48小時(shí))，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。4.8.2.2. 取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的

21、試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)取未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光，為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照的MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)為陰性。如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。4.8.3. 分離培養(yǎng) 如呈現(xiàn)MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)12ml環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)。

22、若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。表1 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí)，若EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗(yàn)，確認(rèn)大腸埃希菌。為了規(guī)范操作，以下是對(duì)藥典要求的補(bǔ)充。4.8.4. 純培養(yǎng) 如EMB或麥康

23、凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選23個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)1824h，作以下檢查。如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)1824h，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。4.8.5. 革蘭染色、鏡檢4.8.5.1. 以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過(guò)火焰23次(載玻片燙手)固定。4.8.5.2. 滴加結(jié)晶紫染液，染色1

24、分鐘，水洗。4.8.5.3. 滴加碘液，媒染1分鐘，水洗，以濾紙吸干余水。4.8.5.4. 滴加95乙醇，脫色2030秒鐘，水洗。4.8.5.5. 滴加沙黃染液，復(fù)染1分鐘，待干后，鏡檢。4.8.5.6. 染色結(jié)果 革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭氏陰性呈紅色。大腸埃希菌為革蘭陰性短埃希菌，或球埃希菌狀，亦有埃希菌狀。4.8.5.7. 注意事項(xiàng)（1）玻片必須潔凈，無(wú)劃痕。涂片的菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成片。不利菌細(xì)胞染色反應(yīng)判斷及形態(tài)觀察。（2）培養(yǎng)物的菌齡以1624小時(shí)為宜。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，革蘭陽(yáng)性菌易染成紅色。（3）脫色是關(guān)鍵。脫色時(shí)間不足，菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性；脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌細(xì)胞易染

25、成陰性。（4）可用已知革蘭染色為陽(yáng)性、陰性的菌種做染色的質(zhì)量控制。4.9.生化試驗(yàn)4.9.1. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)2448h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無(wú)論大?。楸苊膺t緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接中5%乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽(yáng)性?；蜻m當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。4.9.2. 靛基質(zhì)試驗(yàn)() 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。98的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性，一般24

26、小時(shí)即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。常以無(wú)菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24小時(shí)，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。4.9.3. 甲基紅試驗(yàn)(M) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液23數(shù)滴(約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴)，輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。4.9.4. 乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(V-P) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振搖，在4小時(shí)(通常

27、在30分鐘)內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。4.9.5. 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(C) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變，無(wú)菌苔生長(zhǎng)為陰性。4.10.結(jié)果判定4.10.1. 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，供試品MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。4.10.2. MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗(yàn)為、革蘭陰性埃希菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、IM

28、ViC試驗(yàn)為、革蘭陰性埃希菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。4.10.3. 供試品培養(yǎng)物檢查不符合4.10.2中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。4.10.4. 當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)但非大腸埃希菌，不能做出檢驗(yàn)報(bào)告。4.11.注意事項(xiàng)4.11.1. MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌、埃希菌和芽孢菌，其MUG為陽(yáng)性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量，可排除革蘭陽(yáng)性菌的干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出亦判為不合格。4.11.2. 配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過(guò)7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則