皮質(zhì)骨I型膠原的提取及膠原明膠支架材料的制備

1、皮質(zhì)骨I型膠原的提取及膠原-明膠支架材料的制備【摘要】探討一種較理想的皮質(zhì)骨I型膠原的提取方式并制備膠原-明膠支架材料。方式以牛皮質(zhì)骨為原料，經(jīng)低溫液氮粉碎、梯度脫水、脫脂、脫鈣處置成為脫鈣骨基質(zhì)粉。通過酶溶解法處置脫鈣骨基質(zhì)粉，經(jīng)溶解、離心、透析、凍干等步驟取得皮質(zhì)骨膠原，SDSPAGE電泳、氨基酸分析等方式鑒定其特點(diǎn)；再以膠原、明膠通過冷凍干燥技術(shù)制備神經(jīng)支架材料，掃描電鏡觀看其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。結(jié)果所得膠原經(jīng)SDSPAGE電泳、氨基酸分析等方式鑒定符合I型膠原特點(diǎn)；制備的支架材料外觀呈圓柱狀，內(nèi)部為孔徑均勻平行排列的微管結(jié)構(gòu)，具有仿生成效。結(jié)論皮質(zhì)骨中能夠取得純度較高的I型膠原，可用于膠原材料的

2、制作?！娟P(guān)鍵詞】組織工程膠原提取神經(jīng)支架Abstract：ObjectiveTodevelopanidealmethodforextractingtypeIcollagenfromcorticalboneandtoprepareacollagengelatinscaffold.MethodThecorticalbonewasdisintegratedintobonematrixpowderinahighspeedmillandwassubsequentlydehydratedinalcohol,decalcificatedinhydrochloricacidanddefattedinchlor

3、oform:methanol(1:1,v/v).Theosseinswereextractedusingimprovedpepsindigestionmethodafterthebonematrix powderwasdissolved,centrifuged, dialyzed andlyophilized.TypeIcollagenwasthencharacterizedbySDSPAGEandaminoacidcompositionanalysis.ThebiomaterialwasmadeoftypeIcollagenandgelatinusingfreezedryingmethod,

4、andthealignmentregularitiesofmicroscopicchannelsandtheircoursedirectionswereobservedunderthescanningelectronicsizeofthemicroporesandthefactorofporositywerealsomeasured.ResultThecollagenextractedwasconfirmedtobetypeIcollagenbySDSPAGEandaminoacidcompositionanalysis.Allthescaffoldslookedlikecircularcyl

5、inder,themicroscopicchannelswerearrangedinparallelmanners,andtheporesizesofthechannelswereuniform.ConclusionOsseinextractedfromcorticalboneisarealtypeIcollagenthatcanbeappliedintheconstructionofcollagenproducts.Keywords：tissueengineering;collagen;extraction;nervescaffold周圍神經(jīng)缺損后的修復(fù)再生和功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)

6、和熱點(diǎn)。由于周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能上的特殊性，損傷后大多數(shù)情形下無法直接對(duì)拉吻合，自體神經(jīng)移植又有諸多限制，因此尋覓一種神經(jīng)替代物來修復(fù)缺損是十分必要的。最近幾年來，隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)展，用于神經(jīng)修復(fù)研究的材料品種愈來愈多。目前I型膠原蛋白制品為組織工程修復(fù)神經(jīng)研究中應(yīng)用較多的生物材料之一EloI型膠原通常來自牛腱、鼠尾或皮膚，由于上述組織中含有大量其它種類的膠原和非膠原成份，提取及純化工藝復(fù)雜。骨中I型膠原含量豐碩，占骨基質(zhì)中有機(jī)成份的95%以上，本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)的酶提取法加以改良，提取牛皮質(zhì)骨中I型膠原并制備神經(jīng)支架材料。1材料與方式骨基質(zhì)粉的制備取新鮮牛長骨，去除軟組織、骨膜、骨端松質(zhì)骨及骨髓

7、，然后將皮質(zhì)骨劈成骨塊，乙醇（60%、70%、80%、90%）梯度脫水，液氮冷凍后放入高速組織粉碎機(jī)中，粉碎為直徑2mm骨粉，持續(xù)攪拌下加入甲醇:氯仿（1：Lv/v）脫脂48h,每24h換脫脂液1次；mol/L鹽酸脫鈣84h,別離于第1二、3六、60h換脫鈣液，脫鈣終止后去離子水洗滌3次備用。膠原的提取將50g牛皮質(zhì)骨基質(zhì)粉浸在500mlmol/L冰醋酸和500mg胃蛋白酶混合溶液中，持續(xù)攪拌96h。待混合物變成無色、透明、粘稠液體后高速低溫離心20min(10000r/min),以去除未溶解雜質(zhì)。其上清即為液態(tài)粗制膠原。在上清中緩慢加入NaCL攪拌留宿，離心20min(15000r/min)

8、,去上清，沉淀物加入mol/L冰醋酸溶解，離心20min(15000r/min),取上清加入5mol/LNaOH調(diào)pH至，緩慢加入NaCl,攪拌留宿，離心20min(15000r/min),去上清,沉淀物加入mol/L醋酸中透析溶解，離心10min(15000r/min),去沉淀，上清裝入透析袋中持續(xù)透析72h,每4h改換透析液1次。最終收成無色透明粘性液體，濃縮凍干。以上液體及操作在47進(jìn)行。支架材料的制備稱取樣品150mg、明膠(Sigma公司)75mg溶于mol/L冰醋酸溶液,4條件下攪拌90min(18000r/min),負(fù)壓抽真空后于4冰箱中留宿，充分混合成凝膠狀懸濁液后將其注入長1

9、0cm、內(nèi)徑3mm的硅膠管中，密封兩頭，順軸向以自制微型調(diào)速儀以2義10-5111/s的速度浸入冷凝劑中，將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷的鋁盤中，于-40、lOOmTorr條件中凍干48h,制得干燥成形的膠原蛋白支架材料2。材料用戊二醛交聯(lián)，60C。消毒密封備用30膠原的鑒定取樣品2Ug溶于420U1加樣緩沖液（1mol/LTrisHC1緩沖液，10%SDS,2%筑基乙醇，50%甘油，微量濱酚藍(lán)）留宿，100,5min,離心10min（12000r/min）,取上清20U1加樣，進(jìn)行SDSPAGE垂直平板電泳，濃縮膠5%,分離膠8%,電極緩沖液SDSTris甘氨酸系統(tǒng)，濃縮膠電壓40V,分離膠

10、電壓80V,%考馬斯亮藍(lán)R250染色，以牛腱I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）作為對(duì)照。將凍干樣品水解后，應(yīng)用Beckman121MB型氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸分析。用U2001紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定膠原最大光吸收波長。支架材料內(nèi)部掃描電鏡觀看以掃描電鏡觀看上述制備的膠原蛋白支架材料橫截面和縱切面并測(cè)量材料內(nèi)部微孔的直徑。2結(jié)果選擇適那時(shí)刻點(diǎn)換脫鈣液，持續(xù)脫鈣84h,可將骨粉中的鈣離子含量降到較低水平（圖1）。膠原樣品鑒定結(jié)果提取的樣品凍干后呈疏松的白色海綿狀，具有吸潮性（圖2）。SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，提取的膠原樣品與I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品相同（圖3）0最大光吸收波長查驗(yàn)結(jié)果樣品在230nm波優(yōu)

11、勢(shì)顯示較強(qiáng)的光吸收,符合膠原特性。樣品氨基酸分析結(jié)果甘氨酸占氨基酸總量的臨羥脯氨酸占氨基酸總量的，脯氨酸占氨基酸總量的臨羥脯氨酸與脯氨酸之比約，氨基酸組成比符合I型膠原特性（表1）。表1皮質(zhì)骨磁針原氨基酸組成掃描電鏡觀看結(jié)果支架材料外觀為表面封鎖的圓柱狀結(jié)構(gòu)，電鏡下見縱切面為軸向平行排列的微管結(jié)構(gòu)，橫切面上微管結(jié)構(gòu)呈內(nèi)徑均一的蜂巢狀散布，孔徑在20100nm,接近于坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)（圖4、5）o3討論最近幾年來,應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建種子細(xì)胞和具有良好生物相容性的支架材料復(fù)合體一一人工神經(jīng)修復(fù)外周神經(jīng)損傷成為研究的重點(diǎn)。人工神經(jīng)研究的關(guān)鍵之一在于如何選擇適合的支架材料，以便復(fù)合種子細(xì)胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子

12、從而更好的發(fā)揮促神經(jīng)再生作用。目前，以天然的細(xì)胞外基質(zhì)為原料制備支架材料成了研究的新方向。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的要緊成份，普遍散布于骨、肌腱、韌帶、皮膚、軟骨等結(jié)締組織中，約占動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的1/41/3,在細(xì)胞的分化、運(yùn)動(dòng)化趨向、結(jié)締組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)具有生物可降解性、低抗原性、低毒性、能誘導(dǎo)細(xì)胞再生及易取得性等諸多優(yōu)勢(shì)，可參與組織愈合進(jìn)程，在軟骨細(xì)胞再生誘導(dǎo)4、角膜移植:51人工皮膚制備6等方面取得普遍應(yīng)用，應(yīng)用在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中亦能刺激改善神經(jīng)的再生7。圖1鈣離子濃度轉(zhuǎn)變圖2凍干樣品圖3樣品電泳圖譜圖4掃描電鏡下觀看支架材料橫切面(X400)圖5掃描電鏡下觀看支架材料縱切

13、面(X200)以往膠原的提取多集中在相對(duì)易于處置的牛腱、豬皮和鼠尾腱。由于膠原是一個(gè)大的蛋白家族，從上述組織中提取時(shí)分型、純化難度較大,程序復(fù)雜，而且耗時(shí)較長，易致使膠原變性。骨膠原的提取純化報(bào)導(dǎo)較少，而骨中有機(jī)質(zhì)90%以上為膠原，要緊為I型膠原，有望作為制備I型膠原的重要來源。作者將傳統(tǒng)的酶溶解法加以改良應(yīng)用于骨膠原的提取，在骨粉顆粒直徑、脫脂脫鈣時(shí)刻、酶促溶解、抽提次數(shù)等方面加以細(xì)化，省去分型、純化等冗長程序，耗時(shí)較短，經(jīng)濟(jì)簡便。I型膠原的氨基酸組成中，甘氨酸約占氨基酸總量的1/3;含有羥賴氨酸和羥脯氨酸，一樣蛋白質(zhì)中那么不存在羥賴氨酸，羥脯氨酸也很少見;羥肺氨酸與脯氨酸之比約為。本實(shí)驗(yàn)樣

14、品膠原氨基酸分析符合工型膠原的組成特點(diǎn)，最大光吸收波長在230nm周圍，電泳分析其區(qū)帶與I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)帶相同。結(jié)果顯示，作者通過實(shí)驗(yàn)取得了純度較高的I型膠原。作者以實(shí)驗(yàn)取得的I型膠原和明膠為要緊原料，構(gòu)建了具有微管排列結(jié)構(gòu)的支架材料，其內(nèi)徑在20100Um,三維結(jié)構(gòu)上接近于坐骨神經(jīng)，具有必然的仿生成效。實(shí)驗(yàn)說明8,將具有增進(jìn)軸突再生功能的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)種植在支架材料并共培育后，細(xì)胞黏附在支架材料內(nèi)部，生長狀況良好，顯示支架材料具有良好的生物相容性。綜上所述，作者制備的皮質(zhì)骨膠原，具有較高的純度，并可用于膠原蛋白材料的制備，具有較好的有效價(jià)值。參考文獻(xiàn):【參考文獻(xiàn)】1蔣挺大.膠原

15、與膠原蛋白門.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006,242-245.2 EtohS,TakakudaK,KawabataK,etal-EvaluationofcrosslinkingproceduresofcollagentubesusedinperipheralnerverepairJ.Biomaterials,2002,23：4475-4481.3梁偉，羅卓荊，王樹森，等.修復(fù)神經(jīng)缺損的組織工程支架材料的研制及其生物相容性研究J.中華創(chuàng)傷骨科雜志，2004,9：1037-1041.4 WahlDA,SachlosE,LiuC,etal.Controllingtheprocessingofcollagenhydroxyapatitescaffoldsforbonetissueengineeringj.JMaterSciMaterMed,2007,2：201-209.5 LiuY,GanL,CarlssonDJ,etsimple,crosslinkedcollagentissuesubstituteforcornealimplantationJ.InvestOphthalmolVisSci,2006,5:1869-1875.6 IsmarulIN,IshakY,IsmailZ,etal.Characterizationofcollagen/chitosanfilmsf