甜瓜屬人工異源四倍體Cucumis×hytivus早期世代表型與基因表達(dá)變化研究

1、甜瓜屬人工異源四倍體Cucumisxhytivus早期世代表型與基因表達(dá)變化研究多倍體化是高等植物進(jìn)化過(guò)程的重要階段,是植物進(jìn)化的主要?jiǎng)恿χ?。研究表?異源多倍體在形成的早期可發(fā)生廣泛的基因組構(gòu)成和基因表達(dá)水平的變化,與此同時(shí),異源多倍體形成早期也常表現(xiàn)出不同于其二倍體祖先、且不能用孟德?tīng)柖山忉尩男卤硇?這些變化直接關(guān)系到物種的形成和穩(wěn)定。分子標(biāo)記及比較基因組學(xué)的發(fā)展為認(rèn)識(shí)種間雜交和多倍體化進(jìn)程提供了重要依據(jù)。前人研究天然異源多倍體進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的種種變化主要是通過(guò)比較其與二倍體祖先的“候選”后代而進(jìn)行的。但現(xiàn)有的天然異源多倍體大多數(shù)形成于成千上萬(wàn)年以前,基因組經(jīng)歷了長(zhǎng)期的“多倍體二倍化”

2、過(guò)程,其二倍體祖先也不斷進(jìn)化或已滅絕,因此很難確定它們?cè)谠缙谶M(jìn)化中發(fā)生的表型和基因表達(dá)變化的具體過(guò)程和機(jī)制。新合成的異源多倍體及一些“年輕”的異源多倍體,由于其親緣關(guān)系明晰,為準(zhǔn)確、深入研究多倍體基因組進(jìn)化及相關(guān)機(jī)制提供了良好的模式系統(tǒng)。通過(guò)這種模式系統(tǒng),可以精確比較親本二倍體種與人工異源多倍體早期世代間的表型和基因表達(dá)變化特點(diǎn),從而為豐富多倍體物種進(jìn)化理論提供重要的例證。本研究基于實(shí)驗(yàn)室已合成的甜瓜屬人工異源四倍體C.xhytivus(2n=4x=38),比較研究了其早期世代間的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)變化特征、基因表達(dá)變化的特點(diǎn)和黃瓜por基因在異源四倍早期世代的表達(dá)和序列變化特征,探討了異源多倍化

3、引發(fā)以上變化的相關(guān)機(jī)制。具體如下：1.甜瓜屬人工異源四倍體C.xhytivus早期世代表型變化研究研究了甜瓜屬人工異源四倍體C.Xhytivus早期四個(gè)自交世代S1-S4的主要形態(tài)學(xué)性狀、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的染色體行為、雄配子發(fā)育和花粉育性的變化特征。形態(tài)學(xué)研究表明,形態(tài)學(xué)性狀在世代間表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性,其中以節(jié)間長(zhǎng)、側(cè)枝數(shù)、葉片厚度、雄花花梗長(zhǎng)和子房縱徑的變異系數(shù)較大。伴隨自交代數(shù)的增加,該異源多倍體葉片逐漸變薄,子房逐漸變短,其它性狀的變化表現(xiàn)為無(wú)明顯規(guī)律性。減數(shù)分裂行為研究結(jié)果表明,花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I的染色體構(gòu)型以二價(jià)體為主，伴隨著自交代數(shù)的增加，每個(gè)花粉細(xì)胞中平均所含二價(jià)

4、體的比例逐漸增加,單價(jià)體、多價(jià)體等非二價(jià)體比例減少,含19個(gè)二價(jià)體的細(xì)胞數(shù)增加。四分體時(shí)期主要以四分孢子形態(tài)存在,并隨著自交世代的增高,四分孢子所占比例逐漸增加,多分孢子比例逐漸減少。花粉活力分析表明花粉育性伴隨著自交代數(shù)的增加而逐漸提高。以上結(jié)果表明,該異源四倍體在早期進(jìn)化過(guò)程中,花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的染色體配對(duì)行為和雄配子發(fā)育正向穩(wěn)定性方向進(jìn)化。2.甜瓜屬人工異源四倍體C.Xhytivus早期世代基因表達(dá)變化特點(diǎn)研究以甜瓜屬人工異源四倍體C.Xhytivus早期世代S1和S2及其二倍體親本為試材，利用cDNA-AFL環(huán)口reverse-Northernblot技術(shù)比較分析了C.xhyt

5、ivus中基因表達(dá)變化的特點(diǎn)，包括頻率、時(shí)間和類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),親本基因在異源四倍體中大多能表達(dá),部分基因表現(xiàn)為差異表達(dá)。本研究共檢測(cè)到36個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化,占檢測(cè)總基因數(shù)的3.37%,其中29個(gè)表現(xiàn)為沉默,7個(gè)表現(xiàn)為激活。上述變化可發(fā)生于S1代或S2代。對(duì)15個(gè)差異表達(dá)的片段進(jìn)行了回收和測(cè)序,BLAST分析表明這些基因主要是rRNA和蛋白質(zhì)編碼基因。進(jìn)一步的reverse-Northernblot驗(yàn)證了上述結(jié)果。綜合cDNA-AFL附reverse-Northernblot的分析結(jié)果將C.xhytivus中基因表達(dá)變化分為四種類型：雙親基因共沉默、栽培種基因沉默、野生種基因沉默和和基因激活

6、表達(dá),其中單親基因沉默為主要類型。以上結(jié)果表明該甜瓜屬異源四倍體在形成早期發(fā)生著快速的基因沉默和激活。利用cDNA-SSC技術(shù)分析了二倍體親本中部分同源的rpl2基因在甜瓜屬人工異源四倍體C.xhytivus早期四個(gè)自交世代S1-S4中表達(dá)水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)部分同源的rpl2基因在異源四倍體C.xhytivus中表達(dá)水平存在差異,黃瓜rpl2基因表達(dá)水平高于野生種rpl2基因,且在世代間有一定的變化。以上結(jié)果表明異源多倍化誘發(fā)了異源多倍體中部分同源基因表達(dá)水平的變化。3.黃瓜por基因在甜瓜屬人工異源四倍體C.xhytivus早期世代的表達(dá)和序列變化特征為探明不同植物por基因的分子系

7、統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，本研究利用BLAST1序分析了不同物種問(wèn)por基因cDNAJ歹J和POF白質(zhì)的同源性，并利用MEGA.0軟件構(gòu)建了por基因樹(shù),分析了不同por基因間親緣關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同物種在por基因cDNAff列和PORt基酸序列具有較高的保守性，表明不同物種的PORM有相同的功能。研究還發(fā)現(xiàn)，同一物種內(nèi)不同的por基因的cDNAff歹I間存在較大的差異，并存在著物種間por基因的同源性高于物種內(nèi)同源性的現(xiàn)象。以甜瓜屬人工異源四倍體C.xhytivus早期4個(gè)自交世代S1-S4及其二倍體親本為材料，利用RT-PCR和序列比較技術(shù)研究了異源多倍化對(duì)黃瓜por基因分子進(jìn)化的影響?；虮磉_(dá)分析表明,黃瓜por基因在異源四倍體的S1代發(fā)生了快速的沉默,從S2代起又重新表達(dá)，但在S3代和S4代，表達(dá)產(chǎn)物大小發(fā)生了變化。進(jìn)一步的序列分析表明，單