分子診斷學(xué)完整終結(jié)版

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1.分子診斷學(xué):是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法來(lái)研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和2.SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性，指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。3基因(gene)：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必學(xué)的全部核苷酸序列，是遺傳的結(jié)構(gòu)和功能單位。分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。4結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA的編碼序列 調(diào)控基因：保證轉(zhuǎn)錄功能起調(diào)控作用的非編碼序列5操縱子（operon）操縱基因與其控制下的結(jié)構(gòu)基因共同組成的功能單位6斷裂基因：指基因的內(nèi)部存在間隔區(qū)，間隔區(qū)的DNA序列與該基因所決定

2、的蛋白質(zhì)沒有關(guān)系。間隔區(qū)又稱為內(nèi)含子。出現(xiàn)在成熟RNA中的有效區(qū)段為外顯子。7.重疊基因：指基因的開放閱讀框（ORF）存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸重疊的基因8.跳躍基因：又稱轉(zhuǎn)座子，基因在染色體上的位置不固定，能由一條染色體跳到另一條染色體上。9.必須基因：生物體中存在的一些維持生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基因，缺少或突變這些基因均能導(dǎo)致生物體死亡10.基因組（genome）：細(xì)胞中一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和. 11.基因組結(jié)構(gòu)主要指不同的DNA功能區(qū)在DNA分子中的分布和排列12多順反子（polycistron）：操縱子中常常有一至多個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串連一起，受同一個(gè)調(diào)控區(qū)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA

3、分子中。13.黏性末端：基因組雙鏈兩端具有能夠互補(bǔ)的單鏈DNA部分 14.末端正向重復(fù)序列：又稱末端冗余，指病毒雙鏈DNA分子兩端有一段相同的核苷酸 15.末端反向重復(fù)序列（ITR）：指病毒基因組兩端的反向互補(bǔ)重復(fù)序列 16.重疊基因：指兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的ORF共有一段DNA序列 17.分段基因：指病毒基因組由幾條不同的核酸分子組成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及雙鏈RNA病毒 18.LTR：即長(zhǎng)末端重復(fù)序列，逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的dsDNA中，兩端有LTR結(jié)構(gòu)19.DNA重組：是指將不同來(lái)源的DNA分子通過磷酸二酯鍵將末端連接形成重組DNA.20.DNA克?。ǚ肿涌寺。簩⒛骋惶囟―N

4、A片段通過重組DNA技術(shù)插入到一個(gè)載體（質(zhì)粒和病毒等）中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片段的群體。21.限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（RFLP）：個(gè)體之間DNA的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱RFLP。22.限制性核酸內(nèi)切酶（RE）:重要的工具酶之一。RE是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶.(水解磷酸二酯鍵)23.DNA聚合酶 是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA聚合酶，分子量為.具有3聚合酶活性、35核酸外切酶活性 、5-3核算外切酶活性的工具酶。24.Kleno

5、w片段：用特異性的蛋白酶可將DNA聚合酶 裂解為小片段與大片段，大片段即Klenow片段，具有5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，而失去了53外切酶活性，是分子生物學(xué)研究的常用工具酶25.TaqDNA聚合酶：一種耐熱的依賴DNA的聚合酶。具有53聚合酶活性和依賴于聚合作用的53外切酶活性。（最佳作用溫度是7080，TaqDNA聚合酶可用于DNA測(cè)定及通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增）26.同工異源酶：在DNA上，來(lái)源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。27.逆轉(zhuǎn)錄酶：是具有依賴RNA的DNA聚合酶活性、核酸酶H的水解作用、以DNA為模版的DNA聚合酶作用的多功能酶。28

6、.末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶）TdT：在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，催化轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3'-OH末端的工具酶。29.連接酶：催化雙鏈一端的與另一雙鏈'端的磷酸根形成'，磷酸二酯鍵，將具有相同黏性末端或平端的兩條雙鏈DNA片段連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組，其催化黏性末端連接效率要比平末端高得多。30.堿性磷酸酶：用于催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基團(tuán)的工具酶。31.T4多核苷酸激酶：來(lái)源于T4噬菌體感染的大腸桿菌 包括前向反應(yīng)和交換反應(yīng)。用于催化ATP上的-磷酸轉(zhuǎn)移到鏈的端上的工具酶32.核酸酶：可用于水解雙鏈DNA、或DNA雜

7、交分子的單鏈部分的工具酶33.載體（vector）：是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具，本質(zhì)為DNA。34.克隆載體：能將目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生大量目的基因的載體稱為克隆載體。35.分子診斷主要特點(diǎn)：直接以疾病基因?yàn)樘剿鲗?duì)象，屬于病因?qū)W診斷，對(duì)基因的檢測(cè)結(jié)果不僅具有描述性，更具有準(zhǔn)確性；可準(zhǔn)確診斷疾病的基因型變異，基因表型異常以及由外源性基因侵入引起的疾?。混`敏度高，便于早期診斷及疾病預(yù)防；以基因分析為基礎(chǔ)，特異性高。36分子診斷三個(gè)階段:(第一個(gè)階段：準(zhǔn)備和醞釀階段 1953年前，蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。（三個(gè)實(shí)驗(yàn)：肺炎雙球

8、菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)）、第二個(gè)階段：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)、中心法則、PCR技術(shù)第三個(gè)階段：2001年，首張人類基因組序列圖譜及其他物種基因組序列的公布。基因組分、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的巨大技術(shù)進(jìn)步，促進(jìn)進(jìn)入第三階段，即以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集型技術(shù)。主要應(yīng)用：感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤的分子診斷，個(gè)體化醫(yī)療，其他如耐藥性、療效監(jiān)測(cè)，多基因疾病37.四項(xiàng)生物技術(shù)：細(xì)胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基因擴(kuò)增技術(shù)38.C值：基因組的大小，常用堿基數(shù)目或堿基對(duì)數(shù)目來(lái)描述C值是特異的，物種不同，差異極大， 真核生物中，一般隨著進(jìn)化，C值增大C值矛盾：又稱C值悖論，生物的進(jìn)化

9、程度與基因組大小不完全成比例的現(xiàn)象39.真核生物基因組基本特征：有細(xì)胞核基因組和細(xì)胞器基因組之分；核基因組以線狀DNA分子的形式存在于染色質(zhì)上；基因多數(shù)為斷裂基因，有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和大量重復(fù)序列；單順反子，基因家族；核基因組由染色體DNA組成，分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與蛋白質(zhì)結(jié)合。40.注意點(diǎn)：染色質(zhì)的基本組成單位是核小體，由組蛋白核心和周圍的DNA組成。組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個(gè)分子組成核心即組蛋白八聚體一個(gè)基因有n個(gè)內(nèi)含子，則相應(yīng)有n+1個(gè)外顯子重復(fù)序列分為4類：?jiǎn)我恍蛄?、輕度重復(fù)序列（210個(gè)拷貝）、中度重復(fù)序列（1012個(gè)拷貝）、高度重復(fù)序列（1萬(wàn)以上）多基因家族：一些有編碼功能

10、的重復(fù)序列，即指起源相同，序列相似，功能相關(guān)的的一組基因，分為基因簇（相對(duì)集中分布在某一染色體的特定區(qū)域）和另一類基因家族成員在整個(gè)染色體上散在分布，甚至位于不同染色體超基因家族：由基因家族和單基因組成的較大的基因家族，結(jié)構(gòu)不等的同源性，功能不一定相同假基因：基因家族中有的成員因突變而失活，不能表達(dá)出有活性的產(chǎn)物。41人類基因組計(jì)劃（HGP）：旨在測(cè)出人類基因組30億堿基對(duì)的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并確定它們?cè)谌旧w上的位置，破譯人類全部遺傳信息，發(fā)展基因組學(xué)新技術(shù)，探討人類基因組研究的社會(huì)法律與倫理等問題的一個(gè)國(guó)際性研究項(xiàng)目。1） 主要任務(wù)：人類的DNA測(cè)序，包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理

11、圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜等的繪制2）測(cè)序策略：經(jīng)典的逐步克隆法、全基因組鳥槍法 3）人類基因組概貌：GC含量：平均41%（33%65%）CpG島：即二核苷酸CG染色體的重組率 基因突變率：男性多見重組序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、衛(wèi)星DNA、Tn等單核苷酸多態(tài)性（SNP）含量基因數(shù)量：2、6萬(wàn)3、9萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)量：選擇性剪接較多，使得蛋白質(zhì)多而復(fù)雜疾病基因 人基因組序列：99、99%相同 4）人類基因組多樣性：同一人種或不同人種基因組存在或多或少的差異。 通常DNA分子中某一特定位點(diǎn)的變異頻率低于1%為基因突變，高于1%為DNA分子多肽。人類DNA分子多肽性的產(chǎn)生有以下幾種主要方式：重復(fù)序

12、列單元的拷貝數(shù)變異，如微衛(wèi)星DNA多態(tài)性 轉(zhuǎn)座因子導(dǎo)致的分子多肽，如Alu序列多態(tài)性單個(gè)核苷酸的變異即SNP 42原核生物基因組一般特點(diǎn)：基因組相對(duì)較小，通常為一條雙鏈DNA分子 功能相關(guān)的基因高度集中，構(gòu)成操縱子重復(fù)序列少，大多數(shù)的蛋白質(zhì)基因保持單拷貝形式，RNA基因常是多拷貝沒有內(nèi)含子，基因連續(xù)多順反子，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位絕大部分DNA都是用于編碼蛋白質(zhì)的，只有很少不編碼序列DNA分子中有各種功能區(qū)43、質(zhì)粒是多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物細(xì)胞的染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子44.遺傳特性：雙鏈環(huán)狀DNA分子，且為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）質(zhì)粒復(fù)制有賴于宿主細(xì)胞的復(fù)制，但其自身基因可控制合成的時(shí)限

13、及拷貝數(shù)垂直傳遞 不影響宿主細(xì)胞代謝，但可能賦予宿主細(xì)胞新的表型治理的復(fù)制方式為半保留復(fù)制。單向/雙向，單向，雙向。45.特性：質(zhì)粒的不相溶性：兩種不同質(zhì)粒如果利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，會(huì)在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過程中相互競(jìng)爭(zhēng)，因而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。這兩種質(zhì)粒屬于同一不相容群（InC）。質(zhì)粒的穩(wěn)定性：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定存在不被丟失稱為質(zhì)粒的穩(wěn)定性。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性。質(zhì)粒的 選擇性標(biāo)記。46.質(zhì)粒的拷貝數(shù)：在正常生長(zhǎng)條件下，每個(gè)宿主細(xì)胞或每條染色體所對(duì)應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。由其攜帶的復(fù)制子決定。復(fù)制子是一個(gè)復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)及其相關(guān)的調(diào)控元件。質(zhì)粒的復(fù)制由

14、復(fù)制子與調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用來(lái)啟動(dòng)。47.松弛型質(zhì)粒：以RNA為調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒的復(fù)制不需任何自身編碼的蛋白質(zhì)，完全由宿主細(xì)胞提供的壽命較長(zhǎng)的酶及其他蛋白質(zhì)因子來(lái)完成，這些質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細(xì)胞的控制，以所謂的“松弛”方式進(jìn)行。屬高拷貝質(zhì)粒。48.嚴(yán)緊型質(zhì)粒：攜帶與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子相互作用的復(fù)制子的質(zhì)粒。屬低拷貝質(zhì)粒。49.轉(zhuǎn)座因子：又稱可轉(zhuǎn)座元件，指能在基因組中從一個(gè)位點(diǎn)移至另一位點(diǎn)的DNA序列。1）轉(zhuǎn)座現(xiàn)象或移位：指由可移動(dòng)因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座作用結(jié)果：a.導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組DNA的插入突變或基因重排，是毗鄰基因失活或表達(dá)水平下降。b.轉(zhuǎn)座因子被認(rèn)為是基因組進(jìn)化的重要推動(dòng)力量，還可作為

15、遺傳學(xué)研究及基因工程的工具。2）原核生物轉(zhuǎn)座因子的種類：插入序列（IS）、轉(zhuǎn)座子（Tn）、可轉(zhuǎn)移性噬菌體。IS：a.IS兩端有正向重復(fù)序列（DR）和反向重復(fù)序列（IR）；b.IR結(jié)構(gòu)的對(duì)稱使IS既可正向插入靶位點(diǎn)，也可反向插入靶位點(diǎn)；c.IS的中間位編碼序列，僅編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶，含有依賴p因子的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)及終止密碼，從而導(dǎo)致插入位點(diǎn)的基因失活或表達(dá)水平下降。Tn：基因組中存在的能自主復(fù)制和位移的一些DNA序列。特點(diǎn)：a.兩端有反向重復(fù)序列；b.轉(zhuǎn)座后靶位點(diǎn)重復(fù)序列是正向重復(fù)序列；c.編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白；d.可以在基因組中移動(dòng)。50.轉(zhuǎn)座類型：復(fù)制型轉(zhuǎn)座、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座。復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子

16、在轉(zhuǎn)座過程中能夠復(fù)制，結(jié)果是供體與受體都有一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶和解離酶。非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子不復(fù)制，直接從一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)，結(jié)果是供體失去一個(gè)轉(zhuǎn)座因子而受體得到一個(gè)轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶。51.病毒基因組：1)特點(diǎn)：只有一種核酸，4種類型，為雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA 核酸大小差別較大（1.3×103bp3.6×106bp） 具有啟動(dòng)子和操縱子結(jié)構(gòu) 具有重疊結(jié)構(gòu)2）結(jié)構(gòu)：帽子和poly（A）尾結(jié)構(gòu)，對(duì)RNA起保護(hù)作用，并于病毒感染性有關(guān) 52.分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶有：限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶,逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶，堿性磷酸酶，

17、多核苷酸激酶等。53.限制性核酸內(nèi)切酶（RE）命名：Hind H產(chǎn)生該酶的宿主菌屬名大寫，斜體in代表宿主菌的種名縮寫小寫，斜體d代表宿主菌的株或型正體代表同一種菌株中不同限制酶的編號(hào)（按發(fā)現(xiàn)先后順序）羅馬數(shù)字?；貑柦Y(jié)構(gòu)：通常是雙鏈DNA分子中按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序列。星號(hào)活力：RE在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，能切割一些與其特異識(shí)別順序類似的序列，酶的特異性降低，這種現(xiàn)象稱為星號(hào)活力，使用時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生星號(hào)活力。54.DNA聚合酶.（1）DNA聚合酶 和Klenow片段（2）TaqDNA聚合酶55.Klenow片段的主要用途：補(bǔ)齊雙鏈DNA的3端，使3端標(biāo)記；在cDNA克隆中，第二股鏈的合成；DNA序列分

18、析56.逆轉(zhuǎn)錄酶：（多功能酶）功能：（1）依賴RNA的DNA聚合酶活性，以RNA為模版，4種dNTP為底物（此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄作用），催化合成DNA。（2）核酸酶H的水解作用（3）以DNA為模版的DNA聚合酶作用57.末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶）TdT功能：在載體或目的基因3端上加上互補(bǔ)的多聚體尾，形成便于重組的人工黏性末端用于DNA片段3端的同位素探針標(biāo)記58.DNA連接酶主要有兩者：大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶輔基分別為 NAD+（只能連接黏性末端）ATP（既能連接黏性末端，又能連接平末端）重組DNA技術(shù)中常用T4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最初來(lái)自受T4

19、噬菌體侵染的大腸桿菌，但目前的分離純化手段已能快速而又簡(jiǎn)便的得到大量高度特異性酶。注意：DNA分子磷酸二酯鍵的斷裂稱為切口（Nick），可以用T4 DNA連接酶來(lái)修復(fù)。DNA分子中核酸缺失，稱缺口（gap），不能單獨(dú)用連接酶來(lái)修復(fù)。59.堿性磷酸酶(1)細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）由大腸桿菌分離出來(lái)的(2)小牛腸堿性磷酸酶（CIP）由牛腸道分離出來(lái)的（兩個(gè)催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基團(tuán)）主要用途：.除去DNA段上的5磷酸，以防自身連接。.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)記前，除去RNA或DNA上5端的磷酸，以便進(jìn)一步用32P標(biāo)記的r-磷酸重新磷酸化，使5端段被32P標(biāo)記。6

20、0 核酸酶S1的作用：.除去雙鏈DNA的黏性末端以生產(chǎn)平末端。.除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 .分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況等。載體主要有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。根據(jù)其用途分為克隆載體和表達(dá)載體61.克隆載體常有兩種：質(zhì)粒載體和噬菌體載體 1）質(zhì)粒載體復(fù)制特性：緊密型和松弛型（與宿主有關(guān)）作為克隆載體的質(zhì)粒具備特點(diǎn)：具有松弛型復(fù)制子；在復(fù)制子外存在幾個(gè)單一的酶切入點(diǎn)，以便目的DNA插入；具有插入失活的篩選標(biāo)記，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗生素抗性標(biāo)記；分子量相對(duì)較小和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒缺點(diǎn)：容量較小，一般只能接受小于15kb的外來(lái)DNA。

21、質(zhì)?？寺≥d體用途保存和擴(kuò)增2kb目的DNA 構(gòu)建cDNA文庫(kù)目的DNA的測(cè)序作為核酸雜交時(shí)的探針來(lái)源。目前常用的質(zhì)粒有PBR322，PUC系列，以及由后者衍生而來(lái)的PSP和PGEM系列等。PBR322系列載體特點(diǎn)：帶有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)具有二個(gè)抗生素抗性基因具有較小的分子量具有較高的拷貝數(shù)2）PUC18、PUC19質(zhì)粒載體2)噬菌體載體：噬菌體載體、M13噬菌體噬菌體是指感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌性噬菌體和溶源性噬菌體1） 噬菌體包括插入型和置換型兩類，其主要用途：用作一般的克隆載體；用于構(gòu)建一般的基因體或cDNA文庫(kù)（小于22kb）；用于抗體庫(kù)或隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建; 核酸的序列分析。3、表

22、達(dá)載體和穿梭載體講的很少，了解它們的結(jié)構(gòu)便可P39-41.62.分子克隆的基本步驟:目的基因的制備載體的選擇和制備目的基因與載體的連接重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定63.目的基因的獲取制備方法：（1）基因從文庫(kù)中獲取【基因文庫(kù)（G-文庫(kù)）：是指含有某種生物全部基因隨即片段的重組DNA克隆群。（C-文庫(kù)）：將細(xì)胞的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備出全套的cDNA克隆群】（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（3）人工合成DNA片段（100bp）（4）PCR合成（5）直接從染色體DNA中分離目的基因2）載體的選擇：噬菌體和黏性質(zhì)粒載體常用來(lái)構(gòu)建基因組文庫(kù)，pUC系列常用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)和克隆較小DNA片段

23、，M13噬菌體則用于克隆一些待測(cè)的DNA序列3）目的基因和載體的連接：平末端連接和黏性末端連接（容易些） 黏性末端DNA分子連接（目的基因或DNA插入片段與適當(dāng)?shù)妮d體存在同源粘性末端）：用牛小腸堿性磷酸酶去除載體的5磷酸抑制DNA的自身環(huán)化，使它只能與未經(jīng)堿性磷酸酶處理的外源DNA片段連接 平末端連接法（質(zhì)粒與目的基因無(wú)相同的酶切位點(diǎn)）有以下幾種方法T4DNA連接酶連接人工頭連接通過同聚尾連接4）將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 （1）重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞 目的基因與載體在體外連接成重組體后，需先導(dǎo)入受體細(xì)胞，常用的受體細(xì)胞是大腸桿菌。轉(zhuǎn)化方法：Cacl2處理法電擊法轉(zhuǎn)化作用 ：將重組的DNA分

24、子引入細(xì)菌（原核細(xì)胞），使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)染：將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程（2）重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞Cacl2處理法電擊法聚聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法磷酸鈣-DNA共沉淀法二乙胺乙基-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體融合脂質(zhì)體法細(xì)胞核的顯微注射法l 5）重組體的篩選和鑒定（）根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選：篩選出轉(zhuǎn)化菌，篩選帶重組體的克隆，對(duì)重組體進(jìn)行鑒別。根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇-半乳糖苷酶系統(tǒng)根據(jù)插入的外源性DNA片段的性狀進(jìn)行篩選（2）根據(jù)重組DNA的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選重組子大小鑒別篩選 限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行

25、分析 PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定 核酸分子雜交方法進(jìn)行鑒定 DNA序列分析鑒定64.插入失活效應(yīng)：選用含有兩個(gè)以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個(gè)基因，并導(dǎo)致這個(gè)基因的失活，就可用兩個(gè)含不同藥物的平板，互相對(duì)照，篩選含重組DNA的菌落65.核酸分子雜交基本原理：利用核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成異質(zhì)雙鏈的過程。（可發(fā)生在同源或異源的DNA鏈與DNA鏈之間，也可在RNA鏈與DNA鏈）66.核酸變性（denaturation）：指維系核酸雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鏈斷裂變成單鏈的過程，并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。（黏度減小，浮力密度增大，26

26、0nm處紫外吸收增加，活性降低）（熱變形，酸堿變性，化學(xué)變性）67.Tm（melting temperature）：通常把熱變性過程中DNA變性一半所需要的溫度成為融解溫度。DNA的Tm值在8295之間 Tm影響因素：DNA的均一性堿基組成溶液的離子強(qiáng)度pH變性劑68.DNA復(fù)性（renaturation）：當(dāng)變性條件緩慢去除后，兩條彼此分開的互補(bǔ)單鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。（許多理化性質(zhì)恢復(fù)，但熱變性后驟然冷卻，DNA則不可復(fù)性）退火（annealing）：熱變性后，將溫度緩慢降低而使DNA逐漸冷卻即可復(fù)性的過程。復(fù)性過程分兩步：成核作用（nucleation）和拉鏈作用（zipperi

27、ng）成核作用：兩條核酸單鏈隨機(jī)碰撞形成暫時(shí)局部雙鏈，如果局部雙鏈周圍堿基不能配對(duì)，則迅速解離，重新碰撞直到找到正確的互補(bǔ)序列，這個(gè)過程稱為成核作用。拉鏈作用：在成核的基礎(chǔ)上，兩條單鏈的其余部分堿基迅速互補(bǔ)配對(duì)，就像拉鏈那樣形成完整的雙鏈分子。復(fù)性速度用Cot1/2衡量，Co：?jiǎn)捂淒NA的起始濃度（mol/L），t為時(shí)間（s），Cot1/2表示單鏈DNA的起始濃度與復(fù)性一半所需時(shí)間之積，與復(fù)性速度成反比，與DNA復(fù)雜度有關(guān)影響因素：DNA的分子大小和復(fù)雜度，離子強(qiáng)度，DNA的濃度，溫度69.探針（probe）：廣義上指的是能特異性與特定靶分子發(fā)生相互作用，并能被某些方法所檢測(cè)的分子。70理想探

28、針的特點(diǎn)：高度特異性易于標(biāo)記和檢測(cè)靈敏度高穩(wěn)定且制備方便71核酸探針：指能與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補(bǔ)結(jié)合，并可用特殊方法檢測(cè)的被標(biāo)記的已知核酸序列72.核酸探針的種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針1）基因組DNA探針：制備方法：a.分子克隆 b.采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增特定的基因組DNA片段 優(yōu)點(diǎn)：制備方法簡(jiǎn)便、省時(shí)、易得，穩(wěn)定不易降解，標(biāo)記方法多樣也較成熟2）cDNA探針：cDNA（complementary DNA）：指與mRNA互補(bǔ)的DNA分子，它是以mRNA為模板，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成 優(yōu)點(diǎn)：具有基因組DNA優(yōu)點(diǎn)，且不存在內(nèi)含子和其他高度

29、重復(fù)序列，尤其適用于基因表達(dá)研究（但制備困難）3）RNA探針：雜交效率高，雜交分子穩(wěn)定，不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交較少，不易標(biāo)記，易降解4）寡核苷酸探針：特點(diǎn)：a.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要合成 b.長(zhǎng)度一般為2050nt c.可以識(shí)別靶分子的單個(gè)堿基變化 d.特異性不高，雜交信號(hào)不強(qiáng) 設(shè)計(jì)原則：a.探針長(zhǎng)度一般2050nt b.剪輯成分，Gtc含量在40%60%為宜 c.不應(yīng)存在大于4bp的互補(bǔ)序列 d.避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)多于4次 e.同源性不應(yīng)超過70%或有連續(xù)8個(gè)上堿基同源73核酸探針的標(biāo)記，兩大類（1）放射性核素：最常用，靈敏度和特異性極高，但半衰期短，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，污染環(huán)境（2）非放射性核素

30、：穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)時(shí)間短，但靈敏度74.理想探針標(biāo)記物特點(diǎn)： 高靈敏度 標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響堿基對(duì)的特異性，雜交體的穩(wěn)定性及其Tm值。檢測(cè)方法應(yīng)高靈敏度、特異、假陽(yáng)性率低 標(biāo)記物與探針結(jié)合后穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng) 標(biāo)記物對(duì)環(huán)境無(wú)污染、對(duì)人體無(wú)損傷、價(jià)格低廉。75 放射性核素的標(biāo)記物類型 常用32P 35S 3H 125I 131I其類型特點(diǎn)： 32P:比放射活性 3.4×1014Bq/mmol.最常用。放射性強(qiáng)，釋放的粒子能量高，穿透能力強(qiáng)，靈敏度高，半衰期僅14.4d，射線散射嚴(yán)重而影像分辨率，影響結(jié)果分析。 35S：比放射活性5.55×1013Bq/mmol.釋放

31、的粒子較32P稍低，半衰期87.1d，靈敏度比32P低，散射作用弱，分辨率較高，適用于原位雜交。3H：比放射活性1.07×1012Bq/mmol，釋放的粒子能量較低，半衰期12.1年，采用延長(zhǎng)曝光時(shí)間的方法可產(chǎn)生本底低，分辨率高的結(jié)果，金庸與細(xì)胞原位雜交，可反復(fù)使用，對(duì)環(huán)境影響大。125I、131I：釋放粒子和射線，具有較高敏感性，較強(qiáng)分辨率，危害性大。76放射性核素的標(biāo)記標(biāo)記法：采用體外標(biāo)記法，包括化學(xué)法和酶法 1)化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子和探針分子上活性基團(tuán)間的化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物結(jié)合到探針分子的標(biāo)記方法。 2)酶法：預(yù)先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸分子上，經(jīng)過酶促反應(yīng)將標(biāo)記號(hào)的核苷酸分子或

32、標(biāo)記基因摻入或交換到探針分子中的方法，有切口平移法，隨機(jī)引物法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄法（1）切口平移法：DNaseI Mg2+ 隨機(jī)切割 3OH加d NTP(被標(biāo)記) E.coliDNA聚合酶I全酶切除5端的核苷酸 合成互補(bǔ)單鏈，適用于任何形式的雙鏈DNA但不適合單鏈DNA和RNA（2）隨機(jī)引物法：隨機(jī)引物是人工合成的由6個(gè)核苷酸殘基構(gòu)成的寡核苷酸片斷的混合物。模版DNA變性，加入隨機(jī)引物在Klenow酶催化加入d NTPs(一種被標(biāo)記)，變性形成標(biāo)記探針，適合單雙鏈DNA和RNA探針標(biāo)記3)末端標(biāo)記法：3端標(biāo)記法：模版DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶形成5端突出的DNA，klenow酶+d

33、 NTPs變性得到3端標(biāo)記DNA，經(jīng)變性成3端標(biāo)記單鏈DNA探針 5端標(biāo)記法; T4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）標(biāo)記法、堿性磷性磷酸酶（ALP）切除5端的磷酸基團(tuán) PNK作用轉(zhuǎn)移77.非放射性核素標(biāo)記：生物素、地高辛、光敏生物素、熒光素、酶標(biāo)法ALP 和辣根過氧化酶（HRP）核酸探針的純化：乙醇沉淀法凝膠過濾色譜法核酸探針的檢測(cè)：（1）放射性：放射自顯影 液體閃爍計(jì)數(shù)法（2） 非放射性： 偶聯(lián)反應(yīng)、顯色反應(yīng)（酶促顯色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法）78.核酸分子雜交的類型：固相雜交和液相雜交兩大類 1）液相雜交：將待測(cè)核酸樣品和核酸探針同時(shí)放入雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，然后分離雜交分子和過量的未雜交探針，再對(duì)

34、雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè) 固相雜交：預(yù)先將待測(cè)的靶核酸鏈固定在固相支持物上，然后與溶解于雜交液中的核酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去支持物上未參加反應(yīng)的游離核酸探針，再檢測(cè)雜交信號(hào)，分析結(jié)果。2）常用固相雜交：Southern 印跡雜交 Northern印跡雜交、菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、原位雜交Southern 印跡雜交:指經(jīng)凝膠電泳分離的待測(cè)DNA片斷轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定固相支持物(尼龍膜或硝酸纖維素膜)，然后用標(biāo)記的探針DNA分子檢測(cè)靶DNA的一種方法?；具^程：限制性核酸內(nèi)切酶消化待測(cè)DNA瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片斷DNA變性并轉(zhuǎn)印到固相支持物上預(yù)雜交與特異DNA探針雜交雜交信號(hào)檢測(cè)及結(jié)果分析（

35、轉(zhuǎn)膜方法有毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移）Northern印記雜交：指待測(cè)RNA（主要是mRNA）從凝膠轉(zhuǎn)印到固相支持物上，與標(biāo)化的DNA探針進(jìn)行雜交的印跡技術(shù)。與Southern印跡雜交不同點(diǎn)：a . RNA易被環(huán)境中存在的RNA酶降解，應(yīng)避免RNA酶污染 b. RNA需要在變性劑（甲醛、乙二醛、甲基氫氧化汞）存在下進(jìn)行電泳，保持其單鏈狀態(tài)，防止RNA分子形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不能用堿變性 c. 印跡前將含有變性劑的凝膠用水浸泡除去。79. 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是指生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)技術(shù)之一（細(xì)胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基

36、因擴(kuò)增技術(shù)）特異，敏感，高效，簡(jiǎn)便，重復(fù)性，移易化等優(yōu)點(diǎn)。80.PCR的原理：模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過程，通過變性，退火，延伸，三步反應(yīng)的循環(huán)完成，靶基因的雙鏈DNA通過變性解鏈為單鏈，特異的引物通過退火與單鏈DNA模版結(jié)合，在靶DNA的指導(dǎo)下引物的3端延伸靶DNA的互補(bǔ)鏈完成一個(gè)循環(huán)，理論上每次循環(huán)結(jié)束后靶DNA擴(kuò)增一倍，即靶DNA數(shù)目以2 幾何級(jí)數(shù)方法。（1）反應(yīng)體系：模版DNA，四種dNTP，引物，TaqDNA聚合酶、緩沖液（含Mg2+）（2）變性（denaturation）:模版DNA經(jīng)加熱至95左右一定時(shí)間后，使模版DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈。退火（

37、annealling）:將下降至適宜溫度（一般較Tm低5）引物與變性的DNA單鏈在堿基互補(bǔ)的基礎(chǔ)上形成引物，模版雜交雙鏈。延伸（exension）:將溫度上升至在70左右時(shí)，TapDNA聚合酶催化以引物為起點(diǎn)的從53端DNA鏈延伸反應(yīng)，隨著4種dNTP的摻入，合成新的DNA互補(bǔ)鏈。（3）動(dòng)力學(xué)：y=A(1+R) 估算PCR產(chǎn)量，A為起始模板量，R為擴(kuò)增效率，有平臺(tái)期81常見問題原因分析和處理（1）假陽(yáng)性。靶DNA和非靶DNA的污染 （2）假陰性標(biāo)本處理的原因PCR試劑問題PCR擴(kuò)增儀故障或擴(kuò)增過程中的其他PCR產(chǎn)物鑒定的問題（3）引物二聚體兩引物分子間有較多的堿基配對(duì)，特別是引物3端有互補(bǔ)區(qū)引

38、物模版比例太高，可增加模版用量退火溫度過低循環(huán)次數(shù)過多（4）非特異性PCR產(chǎn)物（5）PCR污染與預(yù)防（6）RNA酶的污染與預(yù)防去除外源RNase污染抑制內(nèi)源性RNase的活性82.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與分析（1）凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。（2）PCR產(chǎn)物的酶切技術(shù)：PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）（3）PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR-SSCP（4）核酸探針雜交分析點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交微孔板雜交RNA探針雜交酶免疫分析Southern 印跡雜交（5）PCR-酶聯(lián)免疫吸附法（6）PCR產(chǎn)物測(cè)序（雙脫氧核苷酸鏈末端終止法、化學(xué)裂解法）83.PCR衍生技術(shù)：巢式PCR，逆轉(zhuǎn)

39、錄PCR，多重PCR，錨定PCR，反向PCR，免疫PCR，原位PCR，定量（QPCR）巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。84.熒光定量PCR技術(shù)：1）基本原理：基于熒光能量傳遞技術(shù)，通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物熒光信號(hào)的檢測(cè)

40、，對(duì)起始模版進(jìn)行定量分析。85.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time FQ-PCR）：在熒光定量PCR反應(yīng)中，引物的熒光化學(xué)物質(zhì)，在每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)生一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，利用熒光信號(hào)累積及熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)PCR過程實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)。熒光閾值:設(shè)定在熒光擴(kuò)增曲線上處于熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段是的任意一個(gè)值，一般熒光閾值設(shè)置在3-15個(gè)循環(huán)內(nèi)Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系86.熒光定量PCR技術(shù)：熒光染料法(常用染料：SYBBGreenI)和熒光探針法 探針法：TaqMan技術(shù)，LightCycler探針技術(shù)，分子信標(biāo)技術(shù)，復(fù)合探針

41、法TaqMan技術(shù):3端的熒光Q分子吸收5端熒光R分子的熒光信號(hào)/探針5端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來(lái)/熒光R分子發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例LightCycler探針技術(shù)：有R發(fā)光探針和Q淬滅探針 熒光淬滅的程度與起始模版數(shù)的量成正比分子信標(biāo)技術(shù)：分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導(dǎo)致熒光淬滅/單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補(bǔ)而與之雜交/探針5端和3端分離，淬滅劑對(duì)熒光劑的淬滅作用消失，產(chǎn)生熒光復(fù)合探針法：有R發(fā)光探針和Q淬滅探針 當(dāng)PCR擴(kuò)增溶液無(wú)模版時(shí)，兩探針特異性結(jié)合，無(wú)熒光；有模版，熒光探針與模版結(jié)合，兩探針分離，有熒光87.實(shí)驗(yàn)區(qū)分為

42、四個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個(gè)基本原則：1.四個(gè)區(qū)域必須是相互獨(dú)立的，2.各區(qū)的儀器設(shè)備及物品必須是專用的，3.各區(qū)不能直通，應(yīng)設(shè)有緩沖間，4.產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)安裝排風(fēng)扇或其他抽風(fēng)裝置十六字口訣：各區(qū)獨(dú)立，注意風(fēng)向，因地制宜，方便工作。還應(yīng)設(shè)立臨床標(biāo)本接收區(qū)88.室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）包括測(cè)定前的質(zhì)量控制，統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制，質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)等89DNA序列測(cè)定：即DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，指用人工的方法測(cè)定并分析核酸的堿基組成及排列順序。它是研究基因結(jié)構(gòu)，功能及其關(guān)系的前提，是臨床疾病的分子診斷最為精確的判定依據(jù)四種常用方法：Sanger雙脫氧鏈末端終止法，M

43、anxam-Glibert化學(xué)降解法，焦磷酸測(cè)序技術(shù)，雜交測(cè)序法（1）Sanger雙脫氧鏈末端終止法原理：利用DNA聚合酶，以單或雙鏈DNA為模版以d NTPs（一種被標(biāo)記）為底物，在四組互相獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對(duì)原則，在測(cè)序引物引導(dǎo)下，合成四組有序列梯度的互補(bǔ)DNA鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后識(shí)度待測(cè)DNA的互補(bǔ)序列（2）Manxam-Glibert化學(xué)降解法原理：首先對(duì)待測(cè)單或雙鏈DNA作末端（5端或3端）放射性標(biāo)記，標(biāo)記后的DNA分四組，分別用不同的化學(xué)試劑對(duì)不同的堿基進(jìn)行特

44、異性的化學(xué)切割，通過控制化學(xué)反應(yīng)條件，使堿基斷裂只隨機(jī)發(fā)生在某一個(gè)特定的位點(diǎn)，由此各組均產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，通過（同上）90.自動(dòng)化測(cè)序與傳統(tǒng)方法比較1標(biāo)化物不同： 熒光染料（自動(dòng)） 放射性核素（傳統(tǒng)） 2監(jiān)測(cè)手段不同： 掃描儀/PCR循環(huán)測(cè)序反應(yīng)方法/集束話的毛細(xì)管電泳 放射自顯影/酶反應(yīng)方法/凝膠電泳 特點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，安全無(wú)污染，測(cè)序能力增強(qiáng)91、生物芯片技術(shù)：指通過微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成了成千上萬(wàn)密集排列的分子微陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織、細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物分子進(jìn)行高效、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)（微陣列芯片、微流體芯片） 常用：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯

45、片、液相芯片、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室等。92、基因芯片（Gene Chip）：又稱DNA芯片，DNA微陣列；將大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在載體上制成點(diǎn)陣，稱之為芯片。其原理：經(jīng)過標(biāo)記的待測(cè)樣品DNA通過與芯片上特定位置的探針按堿基配對(duì)原理雜交后，經(jīng)激光聚集熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度來(lái)獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和分析，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量研究。 主要包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品制備及標(biāo)記、樣品與基因芯片的雜交、信號(hào)的檢測(cè)及分析。93、蛋白質(zhì)芯片：指固定于支持節(jié)制上的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的陣列。據(jù)用途分：蛋白質(zhì)功能

46、芯片、蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片。據(jù)載體分：蛋白質(zhì)微陣列、微孔板蛋白芯片、三位凝膠塊芯片。還可分：抗體芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、適配體芯片。94、組織芯片：也稱組織微陣列（TMA），將成百上千個(gè)不同組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列固定在一張載玻片上所成的微陣列。95、液相芯片：又稱懸浮陣列，流式熒光技術(shù)，是基于XMAP技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái)。其核心技術(shù)是把微小的聚苯乙烯微球用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，然后將每種顏色的熒光編碼微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的寡核苷酸或蛋白質(zhì)探針。 優(yōu)點(diǎn)：僅需少量樣本即可同時(shí)定性、定量檢測(cè)同一樣本中的多種不同目的分子最突出優(yōu)點(diǎn)高通量、高效率靈敏度高線性范圍寬重復(fù)性好操作

47、簡(jiǎn)單靈活性好96、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室：又稱微型生物全分析系統(tǒng)（TAS）把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所（波or譜：不認(rèn)識(shí)）及的樣品制備，生物化學(xué)反應(yīng)和檢測(cè)分析的整個(gè)過程集成化，并縮微到一張芯片上自動(dòng)完成，形成所謂的微型全分析系統(tǒng)。97、分子診斷法：（目的物：病原微生物的DNA或RNA） 對(duì)病原體特異性核酸序列的雜交，對(duì)病原體基因序列的限制性內(nèi)切酶酶譜分析，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析，對(duì)病原體基因保守序列的擴(kuò)增檢測(cè)基因芯片技術(shù)，支鏈DNA技術(shù)依賴核酸序列的擴(kuò)增，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。乙型肝炎病毒：PCR 臨床意義：HBV感染的早期診斷，監(jiān)測(cè)治療效果，判斷病情，指導(dǎo)制訂合理的治療方案。結(jié)核分枝桿菌TB： TB DN

48、A檢測(cè)可采用PCR，F(xiàn)QPCR，競(jìng)爭(zhēng)性PCR，免疫雜交PCR等，PCRSSCP血紅蛋白病兩類：由于珠蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異常血紅蛋白?。挥捎谥榈鞍锥嚯逆湹慕M成比例改變和珠蛋白含量降低所導(dǎo)致的地中海貧血鐮狀細(xì)胞貧血：珠蛋白基因中第六位密碼子的序列由原來(lái)的GAC改變?yōu)镚TG，使對(duì)應(yīng)的氨基酸由原來(lái)的谷氨酸纈氨酸 用RE酶切法診斷地中海貧血：分為地貧，地貧，地貧，地貧，地貧，地貧等（一）核酸的分離純化與鑒定：1、核酸分離制備總原則：保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性 盡量排除其他的污染，保證核酸的純度核酸提純的主要步驟細(xì)胞裂解抽提分離核酸純化核酸鑒定2、完整性鑒定：可采用凝膠電泳法，DNA看是否拖尾，RN

49、A為2:1的關(guān)系3、核酸的保存：雙蒸水及TE緩沖液儲(chǔ)存DNA，醋酸鈉溶液或三蒸水、RNA酶儲(chǔ)存RNA4、抑制劑：抑制DNase：A、檸檬酸、EDTA等金屬螯合劑 B、加去污劑SDS C、加蛋白變性劑 抑制RNase：A、高溫高壓滅菌或用DEPC處理 B、加強(qiáng)的蛋白變性劑 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白真核細(xì)胞的破碎方法有超聲波破碎法、勻漿法、液氮破碎法、低滲等物理法和蛋白酶K和去污劑溫和處理法DNA分離純化的方法：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法5、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)：（1）核酸的釋放 目的：裂解細(xì)胞、釋放核酸 物理方法：物理干燥法、凍融法、滲透壓調(diào)節(jié)法 化學(xué)法：酶解法 （2）核酸分離純化：除去非核酸

50、類大分子污染物 不需要的核酸 溶劑等 （3）核酸的濃縮沉淀洗滌：多價(jià)陽(yáng)離子沉淀，70%-75%乙醇洗滌 （4）核酸的鑒定：紫外分光光度法檢測(cè)核酸的濃度及純度（>0.25ug/ml） 熒光分光光度法：溴化乙錠染料6、酚抽提法制備哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA （前處理粗分離精分離）1）、EDTA、SDS等存在下用蛋白質(zhì)酶K消化細(xì)胞 2）酚-氯仿抽提含核酸的水溶液，除蛋白質(zhì)3）氯仿抽提，取水相7、質(zhì)粒提取方法：堿裂解法、煮沸裂解、SDS裂解、CsCl8、蛋白酶K-酚抽提法：（DNA）勻漿組織（SDS、蛋白酶K、EDTA）酚氯仿抽提 水相/有機(jī)相取上層水相乙醇沉淀重溶解DNA9、異硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法：（RNA） 勻漿組織苯酚-氯仿抽提離心后取上層水相乙醇沉淀DEPC水重新溶解RNA（4C/細(xì)胞裂解液、異硫氰酸胍、硫基乙醇、SDS） mRNA提?。篛ligo(dt)-柱層析法實(shí)驗(yàn)區(qū)分為四個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)HGP圖譜：包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜等的繪制如何提高PCR擴(kuò)增的特異性？ 升高退火溫度可增加引物與模板結(jié)合的特異性； 縮短退火和延伸時(shí)間，可減少錯(cuò)誤引發(fā)及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機(jī)會(huì)；降低引物和酶的濃度也