農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化流程

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化流程 方案一1. 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及感受態(tài)的制備 農(nóng)桿菌菌株劃YM平板，26-28培養(yǎng)48 h； 挑取單菌落接種到40 ml 無抗生素的YM液體培養(yǎng)基中，250 r/min， 26-28懸浮培養(yǎng)12-16 h； 將菌液轉(zhuǎn)入滅過菌的50 ml離心管中，4，8000 r/min,離心8 min； 棄上清，加入用100 mM NaCl (4預(yù)冷)重懸收集的農(nóng)桿菌； 4，8000 r/min, 離心8 min； 棄上清，加入原始菌液1/50體積（800m l/管（此時(shí)的感受態(tài)農(nóng)桿菌可以直接用于轉(zhuǎn)化）并分裝成100m l）的20 mM CaCl2重懸菌體； 置液氮中10

2、 s，放入-20冰箱中保存?zhèn)溆谩?.農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化（凍融法）將感受態(tài)農(nóng)桿菌置于冰上，加入1mg質(zhì)粒DNA（體積不宜超過10 m l），充分混勻，冰上放置30 min； 置液氮中快速冷卻約1min后迅速轉(zhuǎn)入37水浴中，待其融化； 加1 ml 無抗生素的YM 液體培養(yǎng)基于28，230 r/min 培養(yǎng)2-4 h；（或直接用1 mlml，留500 m l于管中 3000 r/min 離心2 min收集菌體，將上清吸去500 培養(yǎng)菌直接涂布含抗生素的YM平板）； 重懸菌體并涂布到含有適當(dāng)抗生素的YM平板上吹干, 28培養(yǎng)48 h； 挑取單菌落接種到篩選液體YM培養(yǎng)基中，28，250 r/min 培養(yǎng)48

3、 h，將菌液用于保存或轉(zhuǎn)化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸鏈霉素。在轉(zhuǎn)化前后的所有培養(yǎng)基中均可加入相應(yīng)的這兩種抗生素，以防止雜菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超凈臺(tái)上進(jìn)行。3轉(zhuǎn)基因煙草體系的建立 煙草無菌苗的培養(yǎng)： 70%乙醇消毒煙草種子30 s后，用無菌水清洗兩次，更換NaClO處理25-30 min，無菌水清洗四次； 將滅菌后的種子移至1/2 MS固體培養(yǎng)基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L維生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 瓊脂（KOH 調(diào)至pH 5.7-5.8），于25-26，14 h光照/10 h黑暗條

4、件下萌發(fā)； 14天后，將萌發(fā)出的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有相同1/2 MS培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)盒中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6周，小苗長出后可用于葉盤轉(zhuǎn)化。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化和愈傷組織的篩選于無菌條件下將無菌苗的成熟葉片除去葉邊緣和主要葉脈，切成0.5 cm的小方塊，浸泡在MS液體培養(yǎng)基懸浮的用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液中； 10 min后取出葉片于滅菌的濾紙上吸去菌液，以葉片上表面接觸培養(yǎng)基，8-9片/培養(yǎng)皿，排列于倒有共培養(yǎng)基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 1光照培養(yǎng)箱中，14±mg/L維生素、2.0 mg/L甘氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7%瓊脂、pH 5.7

5、-5.8）的平皿中，置于24 h光照/10 h黑暗條件下共培養(yǎng)48 h； 1恒溫?fù)u床上振蕩漂洗45-60±當(dāng)看到葉片與培養(yǎng)基接觸邊緣長出白色農(nóng)桿菌時(shí)，將葉片轉(zhuǎn)移至不加激素的MS液體培養(yǎng)基中，約28 min，夾出葉片放于滅菌的濾紙上除去多余的液體培養(yǎng)基； 將葉片上表面朝向培養(yǎng)基，8片/皿排列于生芽篩選培養(yǎng)基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、500 mg/L Carbincine、300 mg/L Kanamicine、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L BAP、0.59 g/L MES、1.0 mg/L 1光照培養(yǎng)箱中，14 h光照/10±維生素、

6、2.0 mg/L甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%瓊脂、pH 5.7-5.8）上，置于24 h黑暗條件下培養(yǎng)1個(gè)月； 待愈傷組織長出綠芽時(shí)，切下綠芽并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、200 mg/L Carbincine、100 mg/L Kanamicine、1.0 mg/L維生素、2.0 1光照培養(yǎng)箱中，14 h光照/10±mg/L甘氨酸、1.5%蔗糖、0.6-0.7%瓊脂、pH 5.7-5.8）中進(jìn)行篩選（9棵/組培盒），置于24 h黑暗條件下培養(yǎng)篩選； 將能在生根培養(yǎng)基中長出根的幼苗的芽切下，再次插入到生根培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng) 條件下繼續(xù)篩

7、選，挑選能長出根的煙草幼苗植入土壤生長。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草 方案二1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（1）挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3ml的YEB液體培養(yǎng)基（含鏈霉素Sm 100ug/ml）中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；（2）取過夜培養(yǎng)菌液500ml接種于50ml YEB(Sm 100ug/ml)液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5；（3）5,000rpm, 離心5min； （4）加10ml 0.15M NaCl懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，5,000rpm, 離心5min；（5）1ml 預(yù)冷的20mM CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴，分裝成100m l，液氮中速凍1分鐘，置-70

8、°C保存?zhèn)溆谩?）植物表達(dá)載體向農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取200ml感受態(tài)細(xì)胞，加入1mg構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37°C水浴5分鐘，然后加入1ml YEB培養(yǎng)基，28°C慢速振蕩培養(yǎng)4小時(shí)；1,000 rpm離心30sec，棄上清，加入0.1ml YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm的YEB平板上，28°C培養(yǎng)約48小時(shí)。3）陽性克隆的鑒定 挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)液(含有100ug/ml Kan 和125ug/ml Sm)中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜；小量提取質(zhì)粒

9、DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。4）用于轉(zhuǎn)化煙草的農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種于YEB液體培養(yǎng)液(含有100ug/ml Kan和125ug/ml Sm)中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.60.8；4000rpm，室溫離心10分鐘，用MS鹽溶液（PH7.0）重新懸浮菌體，使用時(shí)采用MS鹽溶液稀釋至原體積的2050倍。5）煙草轉(zhuǎn)化（1）煙草葉片的無菌處理 取溫室生長的煙草葉片，流水下沖洗掉表面雜物，再用蒸餾水洗滌；70%的乙醇滅菌30秒后，無菌水沖洗一次；2.5%次氯酸鈉處理810分鐘；無菌水沖洗三次，備用；（2）無菌的煙草葉片切去邊緣和主要葉脈，切成0.4´0.6cm2大?。唬?）切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘；（4）用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入上鋪一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)；（5）三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基（