克隆載體與表達載體

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接，再導(dǎo)入原核細菌內(nèi)，質(zhì)粒會在原核細菌內(nèi)大量復(fù)制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會表達，但一定被大量復(fù)制?？寺≥d體只是為了保存基因片段，這樣細胞內(nèi)不會有很多表達的蛋白質(zhì)而影響別的工作。       克隆載體(Cloning vector )：攜帶插入外源片段的質(zhì)?；蚴删w，從而產(chǎn)生更多物質(zhì)或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。(這是為“攜帶”感興趣的外源DNA、實現(xiàn)外源DNA的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。) &

2、#160;     其中，為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄、進而翻譯成多肽鏈而設(shè)計的克隆載體又稱表達載體。是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子-核糖體結(jié)合位點-克隆位點-轉(zhuǎn)錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達載體的標志。表達載體：有的是高拷貝的，有的是低拷貝的，各有各的用處，是一些用于工程生產(chǎn)的細菌，被導(dǎo)入的目標基因會在此類細菌中得到表達，生產(chǎn)出我們需要的產(chǎn)物，導(dǎo)入的基因是由克隆載體產(chǎn)出的。表達載體具有較高的蛋白質(zhì)表達效率，一般因為具有強的啟動子。       表達載體（Expression

3、 vectors）就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達的載體。如表達載體pKK223-3是一個具有典型表達結(jié)構(gòu)的大腸桿菌表達載體。其基本骨架為來自pBR322和pUC的質(zhì)粒復(fù)制起點和氨芐青霉素抗性基因。在表達元件中，有一個雜合tac強啟動子和終止子，在啟動子下游有RBS位點（如果利用這個位點，要求與ATG之間間隔5-13bp），其后的多克隆位點可裝載要表達的目標基因。      （RBS位點：1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，原核生物，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點

4、，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游310 bp處的由 39bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點。根據(jù)發(fā)現(xiàn)者的名字，命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱S-D序列。由于它正好與30S小亞基中的16s rRNA3端一部分序列互補，因此S-D序列也叫做核糖體結(jié)合序列。真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻譯的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用來增強真核基因的翻譯效率的。是最優(yōu)化的ATG環(huán)境，避免ribosome出現(xiàn)le

5、aky scan） 克隆載體目的在于復(fù)制足夠多的目標質(zhì)粒，所以常帶有較強的自我復(fù)制元件，如復(fù)制起始位點等，往往在菌體內(nèi)存在多拷貝，所以抽質(zhì)粒會抽出一大堆。但不具備表達元件。而表達質(zhì)粒有復(fù)雜的構(gòu)成，為的是控制目標蛋白的表達，如各種啟動子（T7），調(diào)節(jié)子（LacZ）等，而且以pET為代表的表達載體在菌體內(nèi)都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達。       克隆載體只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管讀碼框什么的，但是表達載體是不但要你的目的基因連在上面，而且要表達蛋白，所以就要求你的讀碼框不能亂了，否則就不能得到你想到的表達產(chǎn)物。1.載

6、體即要把一個有用的基因（目的基因研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。2. 載體的分類按功能分成：（1）克隆載體: 都有一個松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復(fù)制擴增。它是用來克隆和擴增DNA片段（基因）的載體。（2）表達載體 :具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。 按進入受體細胞類型分：（1）原核載體 （2）真核載體 （3）穿梭載體（sbuttle vector） 指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，因而可以

7、運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）.克隆載體 顧名思義就是質(zhì)?？截悢?shù)比較高,在做上游克隆時比較方便, 其重點在于質(zhì)粒的復(fù)制.問題：     基因工程中有克隆載體和表達載體，克隆載體可以在受體菌中大量復(fù)制，表達載體用于表達目的蛋白，那么實際應(yīng)用中，我們的最終目的是要得到目的蛋白，克隆載體不能完成表達，有何用呢？還是說利用克隆載體實現(xiàn)目的基因的大量復(fù)制后，再將其轉(zhuǎn)移到表達載體中實現(xiàn)表達？它是否有何缺陷不能整合克隆載體的功能？構(gòu)建兼有克隆和表達雙重功能的載體有何困難？1.克隆的目的比較單一，就是將你感興趣的DNA片段，重組進入載體，然后于宿主細胞中大量繁殖，主要用于各

8、種文庫的建立，比如人類基因組計劃；同時由于載體所能容納的目的片段的長度是有限的，而克隆載體沒有表達所需的各種片段，所以可以容納更長的目的片段，即可以克隆足夠長的基因，效率更高。2.重組DNA需要使用限制性內(nèi)切酶，因此待克隆的目的片段兩端必需有其識別位點，現(xiàn)在的T/A克隆載體可以直接克隆PCR產(chǎn)物，省去了兩端加裝識別位點的設(shè)計，PCR效率就更高。3.表達載體的目的是多樣化的，為了實現(xiàn)實際工作中的需要，不同的目的就要設(shè)計不同的載體，用表達載體克隆基因不是不可以，實際工作中要考慮更多，因此更復(fù)雜。4.細菌攝取能量的能力是一定的，如果用來合成大量蛋白質(zhì)，合成核酸就會少。5.細菌承受的工作負荷也是有限的

9、，給它的工作太多，效率必然低下，這和我們?nèi)粘Ｉ钍且粋€道理。原因很簡單，不是不能，是完全可以，但是效率會低很多。所以我們一般的策略是，將目的片段克隆于非常簡單的克隆載體上，按照需要再亞克隆于可以滿足各種要求的表達載體上?；卮鸬牟皇呛芟到y(tǒng)，如有問題可以繼續(xù)來信討論，希望對你有所幫助。1) “T/A克隆載體可以直接克隆PCR產(chǎn)物，省去了兩端加裝識別位點的設(shè)計，PCR效率就更高?！笔鞘裁匆馑?？T/A克隆載體是PUC載體的線性化后兩端加了T，而Taq酶有在PCR產(chǎn)物后隨機加A的特性，所以PCR產(chǎn)物直接可以接入T載體。而經(jīng)典的克隆PCR產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶切割后接入載體，所以在設(shè)計PCR引物時兩端要加酶

10、的識別位點，而加裝的序列與模板不配對，因此PCR效率會低很多。2) 克隆載體只是為了得到大量的目的基因，而現(xiàn)在多用PCR就可以達到這個目的。那這個目的基因的主要用途是什么？只用來測序嗎？表達載體應(yīng)該兼有克隆與表達的功能的吧？嗯，基本是這個意思。就測序不克隆也可以進行，克隆到載體的CMS中就在基因兩端有了可供你選擇的很多限制性酶切位點，方便亞克隆到各種表達載體上。當(dāng)然表達載體可以克隆，但是效率低于克隆載體。一是因為表達載體不能直接克隆PCR產(chǎn)物，必須加裝限制性酶切識別序列，上面已經(jīng)講過。二是表達載體的選擇相對克隆載體是更加嚴謹型的質(zhì)粒，就是每個細菌里的拷貝數(shù)較低，能量守恒，細菌攝取能量的能力是一定的，用來合成蛋白質(zhì)，核酸的合成必然受一定得限制。3) 我要構(gòu)建一個基因的載體， 1.我可以將目的基因（1.3kb左右）和表達載體分別作酶切后連接嗎？這幾天將目的基 因做了一個T載體連接，可是不知道下一步怎么利用？2.設(shè)計引物的時候用了sac1和hind111，做pcr的時候可以用pfu酶嗎？pfu酶是必須的嗎？3.我選擇的表達載體上sac1和hind111的酶切位點只是相差兩個堿基，做雙酶切的時候能切開嗎？1.如果你的目的基因已經(jīng)在T載體上，當(dāng)然可以分別酶切后連接，但是要注意方向。2.如果是T載體連接PCR的引物可以不設(shè)計酶切位點。T載體可以直接連接PCR產(chǎn)物源于其末端錯加的A，所以