生物技術概論

1、生生 物物 技技 術術 概概 論論東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 李李 杰杰緒緒 論論一、生物技術的定義 生物技術(biotechnology),也稱生物工程(bioengineering)，是指人們以現(xiàn)代生命科學為基礎，接合先進的工程技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品。 生物技術是有多學科綜合而成的一門新學科。二、生物技術的種類及其相互關系二、生物技術的種類及其相互關系生物技術主要包括以下生物技術主要包括以下5項技術：項技術：1.基因工程（gene engineering）2.細胞工程（cell engineering）3.酶工程（enz

2、yme engineering）4.發(fā)酵工程（fermentation engineering）5.蛋白質工程（protein engineering ）1.基因工程（基因工程（gene engineering） 基因工程是70年代興起的一門新技術，其主要原理是應用人工方法把生物的遺傳物質，通常是DNA分離出來，在體外進行切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA導入某種宿主細胞或個體，從而改變它們的遺傳品性；有時還使新的遺傳信息在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物。也稱DNA重組技術。2.細胞工程（細胞工程（cell engineering） 所謂細胞工程是指以細胞為基本單位，在體外條

3、件下進行培養(yǎng)、反之，或人為地使細胞某些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動、植物個體，或獲得某種有用物質的過程。包括動、植物細胞的體外培養(yǎng)技術、細胞融合技術、細胞器移植技術等。3.酶工程（酶工程（enzyme engineering 所謂酶工程是利用酶、細胞器或細胞所具有的特異催化功能，或對酶進行修飾改造，并借助生物反應器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術。包括酶的固定化技術、細胞的固定化技術、酶的修飾改造技術及酶反應器的設計等技術。 4.發(fā)酵工程發(fā)酵工程（fermentation engineering） 利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝

4、過程特殊等優(yōu)點，在合適條件下，通過現(xiàn)代工程技術手段，由微生物的某種特定功能生產(chǎn)出人類所需的產(chǎn)品稱為發(fā)酵工程，也稱微生物工程。 5.蛋白質工程（蛋白質工程（protein engineering ） 是指在基因工程的基礎上，接合蛋白質結晶學、計算機輔助設計和蛋白質化學等多學科的基礎知識，通過對基因的人工定向改造，從而達到對蛋白質進行修飾、改造、拼接以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質。這這5項技術是互相聯(lián)系、互相滲透的項技術是互相聯(lián)系、互相滲透的三、生物技術涉及的學科三、生物技術涉及的學科 現(xiàn)代生物技術是所有自然科學領域中涵蓋范圍最廣的學科之一。它包括分子生物學、細胞生物學、微生物學、免疫生物學、人

5、體生理學、動物生理學、植物生理學、微生物生理學、生物化學、生物物理學、遺傳學等幾乎生物科學所有的次級學科，又結合了化學、化學工程學、數(shù)學、微電子技術、計算機科學等尖端基礎學科，是一門多學科互相滲透的綜合性學科。四、生物技術對經(jīng)濟社會發(fā)展的影響四、生物技術對經(jīng)濟社會發(fā)展的影響1.改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺。改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺。1.1提高農(nóng)作物產(chǎn)量及品質提高農(nóng)作物產(chǎn)量及品質（1）培育抗逆的作物優(yōu)良品系；（2）植物種苗的工廠化生產(chǎn)；（3）提高糧食品質；（4）生物固氮，減少化肥用量。1.2發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)（1）動物的大量快速無性繁殖；（2）培育動物的優(yōu)良品系。轉基因技術與轉基因生物

6、轉基因技術與轉基因生物 通過基因工程技術對生物進行基因轉移，使生物體獲得新的優(yōu)良品性，稱之為轉基因技術。通過轉基因技術獲得的生物體稱之為轉基因生物。四、生物技術對經(jīng)濟社會發(fā)展的影響四、生物技術對經(jīng)濟社會發(fā)展的影響2.提高生命質量，延長人類壽命提高生命質量，延長人類壽命 （1）開發(fā)新型藥品 （2）疾病的預防和診斷 （3）基因治療 （4）人類基因組計劃（HGP） 3.解決能源危機，治理環(huán)境污染解決能源危機，治理環(huán)境污染 （1）解決能源危機 （2）環(huán)境保護 4.制造工業(yè)原料，生產(chǎn)貴重金屬制造工業(yè)原料，生產(chǎn)貴重金屬 （1）制造工業(yè)原料 （2）生產(chǎn)貴重金屬五、發(fā)展生物技術的重要性五、發(fā)展生物技術的重要性

7、1.生物技術是解決全球性經(jīng)濟問題的關鍵技術。2.生物技術促進傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術改造和新興產(chǎn)業(yè)的形成，對人類社會生活將產(chǎn)生深遠的革命性的影響。 生物技術將是生物技術將是2121世紀高新技術革命的核心世紀高新技術革命的核心內容，生物技術產(chǎn)業(yè)將是內容，生物技術產(chǎn)業(yè)將是2121世紀的支柱產(chǎn)業(yè)。世紀的支柱產(chǎn)業(yè)。第二章第二章 基因工程基因工程l基因工程的基本含義 ： l 按照人們的愿望，進行嚴密的設計，通過體外DNA重組和轉移等技術，有目的地改造生物特性，使現(xiàn)有物種在較短的時間內趨于完善，創(chuàng)造新的生物類型。第一節(jié)第一節(jié) 基因工程工具酶和基因工程工具酶和DNA加工加工 一般把DNA分子切割、 DNA片段末端修飾

8、和DNA片段連接等所用的酶稱為工具酶。一、限制性內切酶一、限制性內切酶 限制性內切酶（restriction endonuclease）是一類一環(huán)狀或線形DNA為底物，能識別DNA種特定核苷酸序列，并在合適反應條件下斷開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生具有3?1OH和5 ?1P基團DNA片段的內脫氧核苷酸酶。目前基因工程中所用的是II型酶。1.限制性內切酶在限制性內切酶在DNA分子上的識別順序分子上的識別順序 限制性內切酶在雙鏈DNA分子上能識別的特定核苷酸序列稱之為識別序列，也稱識別位點。識別序列多數(shù)由4、5、6個核苷酸組成，其共同特點是呈現(xiàn)堿基互補對稱。2.限制性內切酶切割限制性內切酶切割DNA的位點和切

9、割片段的末端的位點和切割片段的末端 II型限制性內切酶的切割位點位于識別序列區(qū)內，不同的酶切割DNA分子后所產(chǎn)生的末端不同。 有些限制性內切酶雖然識別序列不同，但切割DNA分子產(chǎn)生的DNA片段具有相同的末端，稱之為同尾酶。二、二、DNA連接酶連接酶 能催化兩個DNA片段末端之間-P和-OH基團形成磷酸二酯鍵，是兩個末端連接的酶稱為DNA連接酶（DNA ligase）.現(xiàn)用的DNA連接酶有兩種：（1）E.coli DNA 連接酶；（2）T4 DNA連接酶三、三、DNA片段末端修飾酶片段末端修飾酶1.末端脫氧核苷酸轉移酶2.核酸外切酶3.堿性磷酸酶第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆載體基因克隆載體 一般而言，

10、外源基因必須先同某種傳遞者結合后才能進入細菌和動植物受體細胞，把這種能承載外源DNA片段(基因)帶入受體細胞的傳遞者稱之基因克隆載體(gene cloning vector)。 作為基因克隆載體至少必須具備3個條件：(1)具有能使外源DNA片段組人的克隆位點。(2)能攜帶外源DNA進入受體細胞，或游離在細胞質中進行自我復制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復制而復制。(3)必須具有選擇標記，承載外源DNA的載體進入受體細胞后，以便篩選克隆子。一、質粒載體一、質粒載體 質粒載體是最早發(fā)展起來的一類基因克隆載體，以質粒DNA為基礎構建而成，是微生物和植物轉基因研究的主要載體。 質粒是細胞中染

11、色體外的裸露DNA分子，廣泛存在于細菌之中，在某些藍藻、綠藻和真菌細胞中也存在質粒。一個質粒就是一個DNA分子，多數(shù)以超螺旋環(huán)狀共價雙鏈分子形式存在，以ccDNA表示，體外在理化因子作用下可成為開環(huán) 或線形分子。構建質粒載體一般選用分子小和松弛型復制的質粒。至今已構建了不下幾百種的質粒載體，現(xiàn)舉例如下：1.pBR3222.pUC18/19二、噬菌體和病毒載體二、噬菌體和病毒載體1. cosmid載體 由帶cos位點的 DNA片段與質粒構建的載體稱之為cosmid載體。2.CaMV基因克隆載體（1）互補載體系統(tǒng)（2）混合載體系統(tǒng)（3）CaMV35S啟動子融合基因載體系統(tǒng)第三節(jié)第三節(jié) 目的基因導入

12、受體細胞目的基因導入受體細胞一、 受體細胞 所謂基因克隆的受體細胞，從實驗技術上講是能攝取外源 nNA(基因)并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗目的上講是有應用 價值和理論研究價值的細胞。原核生物細胞、植物細胞和動物細胞可以作為受體細胞。1.原核生物細胞原核生物細胞 原核生物細胞是一類很好的受體細胞，容易攝取外界的DNA，增殖快，基因組簡單，便于培養(yǎng)和基因操作，普遍被用作cDNA文庫和基因組文庫的受體菌，或者用來建立生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物的工程菌，或者作為克隆載體的宿主。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應用。2.真核生物細胞真核生物細胞 真核生物細胞作為基因克隆受體近來

13、已受到很大的重視。1.酵母酵母：由于某些性狀類似原核生物，所以較早就被用作基因克隆受體。2.動物細胞動物細胞：也已被用作受體細胞，但由于體細胞不易再分化成個體，所以采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞作為基因轉移的受體細胞，由此培養(yǎng)成轉基因動物。不過最近通過體細胞培養(yǎng)出了多種克隆動物，由此可見動物體細胞同樣可以用作基因克隆的受體細胞。3.植物細胞植物細胞：作為基因克隆的受體細胞，有其優(yōu)于動物細胞的特點，一個活的離體體細胞在合適的培養(yǎng)條件下比較容易再分化成植株，意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)成能傳代的植株，成為轉基因植物。由于這個原因，近年來植物基因工程發(fā)展非常迅速。二、目的基因組入克隆載體

14、二、目的基因組入克隆載體 目的基因導入受體細胞之前，一般須先把含目的基因的DNA片段組入合適的克隆載體。為選用合適的克隆載體，必須注意以下幾點：為了使組入的目的基因能夠在受體細胞中有效表達，應選用具強啟動子的表達載體。根據(jù)確定的受體系統(tǒng)，選用相應的克隆載體，因為用作受體細胞的不同生物類型有各自適用的克隆載體。選用的克隆載體應是便于同含目的基因的DNA片段進行連接。 根據(jù)實驗設計，有了合適的克隆載體和含目的基因的DNA片段，則選用限制性內切酶切割，并用DNA連接酶連接，得到預期的重組DNA分子。三、重組三、重組DNA分子導入原核生物細胞分子導入原核生物細胞 可以通過轉化、轉導和三親本雜交等途徑，

15、 把重組DNA分子導入原核生物細胞。1.轉轉 化化 攜帶基因的外源DNA分子通過與膜結合進人受體細胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達的過程稱為轉化(transformation)。DNA轉化大腸桿菌的技術路線包括制備感受態(tài)細胞和轉化處理。 感受態(tài)細胞指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。2.轉轉 導導 通過噬菌體(病毒) 顆粒感染，把DNA導入被感染的受體細胞的過程稱為轉導(transduction)。含目的基因的DNA與噬菌體(病毒)載體的重組DNA分子導人受體細胞，一般先須進行體外包裝。為此，根據(jù)噬菌體體內包裝的原理，獲得了分別缺D蛋白和E蛋白入噬菌體突變株的兩種溶源菌。這兩種溶源重菌單獨培

16、養(yǎng)，因各缺一種包裝必備的蛋白質，所以體內即使有 DNA也不能進行包裝，因此細胞內積累了大量除一種以外的其他供包裝用的蛋白質。如果在試管內混合兩種溶源菌合成的蛋白質，D蛋白和E蛋白互相補充，就可以包裝 DNA或重組的 DNA。3.重組重組重組重組DNA分子通過三親本雜交轉分子通過三親本雜交轉化大腸桿菌化大腸桿菌 當重組DNA分子不能直接轉化受體菌時，可采用三親本雜交(triparental mating)轉化法。被轉化的受體菌、含重組DNA分子的供體菌和含廣泛宿主輔助質粒的輔助菌三者進行共培養(yǎng)，在輔助質粒的作用下，重組DNA分子被轉移到受體茵細胞內，按照重組DNA分子攜帶的選擇標記篩選克隆子。

17、四、重組四、重組DNA分子導入真核生物細胞分子導入真核生物細胞 由于真核生物的細胞結構較為復雜，適用于原核生物基因轉移的方法不能有效地用于真核生物。近年來經(jīng)過探索，發(fā)展了多種適用于植物和動物轉基因的方法。1. 重組重組DNA分子導入植物細胞分子導入植物細胞（1）用根癌農(nóng)桿菌介導的Ti質粒載體轉化法 含有Ti質粒的根癌農(nóng)桿菌與一些植物的細胞接觸后，Ti質粒的一部分 (T- DNA)可以導人植物細胞，整合到植物基因組中，隨其復制而復制。根據(jù)這一特性可構建一系列Ti質粒載體，與含目的基因的DNA片段重組，導入根癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤轉化法、原生質體共培養(yǎng)法和懸浮細胞共培養(yǎng)法，通過根癌農(nóng)桿菌介導進入植物

18、細胞。 用根癌農(nóng)桿菌介導法已獲得了一些轉基因植物，但是一般局限于雙子葉植物。1. 重組重組DNA分子導入植物細胞分子導入植物細胞(2)重組DNA的直接轉移法 為克服致癌農(nóng)桿菌介導法的受體局限性，近來發(fā)展了電穿孔法、微彈轟擊法、激光微束穿孔法、多聚物介導法和花粉管通道法等，把重組DNA分子直接導入植物細胞。微彈轟擊法：微彈轟擊法： 金屬微粒在外力作用下達到一定速度后，可以進入植物細胞，但又不引起細胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動。利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微粒混勻，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DNA隨高速金屬微粒進入植物細胞。此方法可直接處理植物

19、某器官或某組織，是當今普遍使用的植物轉基因方法。電穿孔法電穿孔法 細胞膜的基本組成是磷脂，在適當?shù)耐饧用}沖電場作用下，細胞膜被擊穿，但還達不到細胞致命傷害。所以當移去外加電場后，被擊穿的膜孔可自行復原。根據(jù)這一性質，植物原生質體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預定的參數(shù)進行直流電脈沖處理，再通過常規(guī)的再分化培養(yǎng)和篩選，可獲得轉基因植株。為避免制備原生質體和原生質體再生植株的困難，近來用此技術享接處理具有完整細胞壁的植物細胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。激光微束穿孔法激光微束穿孔法 利用直徑很小、能量很高的激光微束可引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細胞，

20、處于細胞周圍的重組DNA隨之進入細胞。此方法最適用于活細胞中線粒體和葉綠體等細胞器的基因轉移。多聚物介導法多聚物介導法 聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸和多聚鳥氨酸等是協(xié)助DNA轉移的常用多聚物，尤以PEG應用最廣。這些多聚物同二價陽離子和DNA混合，可在原生質體表面形成顆粒沉淀，使DNA進入細胞內。花粉管通道法花粉管通道法 將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉化尚不具有正常細胞壁的卵、合子和早期的胚胎細胞，在活體內產(chǎn)生轉基因種子。 此外還有人使用顯微注射法和脂質體介導法進行轉化。2.重組重組DNA分子導入哺乳動物細胞分子導入哺乳動物細胞 哺乳動物的細

21、胞不易從周圍捕獲外源DNA ，明顯地影響了哺乳動物轉基因的發(fā)展。近年來通過研究發(fā)展了一系列能有效地將外源DNA分子導入哺乳動物細胞的方法，主要有以下幾種。(1)病毒顆粒轉導法病毒顆粒轉導法 由于病毒的種類繁多，用病毒DNA或RNA構建的載體性質各異，所以轉導的過程各有不同，主要有三種類型：其一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細胞染色體DNA上；其二，帶有目的基因的病毒基因組是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細胞；其三，雖然帶有目的基因的病毒基因：組是缺陷型的，但是被感染的受體細胞的基因組中已整合了病毒缺失的基因，所以沒有必要用輔助病毒混合感染

22、。(2)磷酸鈣轉染法磷酸鈣轉染法 哺乳動物細胞能捕獲粘附在細胞表面的DNA磷酸鈣沉淀物，使DNA轉入細胞。先將待轉染的重組DNA同CaCl2混合制成CaCl2 -DNA溶液，隨后逐漸緩慢地加入Hepers磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在培養(yǎng)的細胞表面上，達到轉染目的。(3)DEAE葡聚糖轉染法葡聚糖轉染法 DEAEdextran(二乙胺乙基葡聚糖)是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞捕獲外源DNA分子?；静僮鬟^程主要有兩種方式：其一，先使病毒的DNA直接同DEAE葡聚糖混合，形成DNADEAE葡聚糖復合物,再處理受體細胞；其二，受體細胞先用DEAE葡聚糖溶液預處理，

23、隨后再同DNA接觸，也可達到轉染目的。(4)聚陽離子聚陽離子DMSO(二甲基亞砜二甲基亞砜)處理轉染法處理轉染法 用聚陽離子(叫ybrene)處理哺乳動物細胞，使細胞表面增加對外源DNA的吸附能力，再用25-30 DMSO處理細胞，增加膜的通透性，提高對DNA的捕獲量，達到有效的轉染。(5)脂質體介導法脂質體介導法 脂質體是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜狀結構，把用來轉染的DNA分子包在其中，通過脂質體與細胞接觸，將外源DNA導人受體細胞。包裝成脂質體的DNA的轉染串比裸露的DNA的轉染率高出100倍。如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質體，可提高轉染率1020倍。在正常

24、情況下，每個細胞平均可吸收1000個左右的脂質體。這是哺乳動物轉基因研究中常用的方法之一。(6)顯微注射轉基因技術顯微注射轉基因技術 鑒于哺乳動物細胞便于注射的特性，常應用顯微注射法把外源DNA分子直接注人細胞。 此外，為便于操作，也可采用“穿刺”法。處于細胞周圍的DNA隨微針穿刺形成的小孔進入細胞，或隨穿刺的針頭帶入細胞。 (7)電穿孔法電穿孔法 其原理和操作過程類似植物細胞的電穿孔 轉移DNA的方法。第四節(jié)、克隆子的篩選和簽定第四節(jié)、克隆子的篩選和簽定 受體細胞經(jīng)轉化(轉染)或轉導處理后，真正導入目的基因并能有效表達的克隆子一般來說只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細胞。為了從處理后的

25、大量受體細胞中分離出真正的克隆子，已建立了一系列篩選和鑒定的方法，主要有以下幾種。一、利用克隆載體攜帶的選擇標記基因一、利用克隆載體攜帶的選擇標記基因篩選克隆子篩選克隆子 1.抗菌素抗性基因 2.lacZ基因 1. 利用抗菌素抗性基因進行篩選利用抗菌素抗性基因進行篩選 不同克隆載體通常分別攜帶不同的抗性基因，如Ampr(抗氨芐青霉素)、Cmpr (抗氯霉素)、Kan r(抗卡那霉素)、Tetr (抗四環(huán)素)和Strr (抗鏈霉素)等。當含任何一種抗菌素抗性基因的載體處理不具這種抗性基因的受體細胞，并在含相應抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，只有獲得載體的受體細胞才能繼續(xù)生長，這樣便可篩選出含克隆載體的克

26、隆子。 要篩選含目的基因的克隆子，可選用具Ampr和Tetr這樣的雙抗選擇標記載體，把含目的基因的DNA片段插入其中之一的Tetr選擇標記基因區(qū)，導致該基因的插入失活。用這樣的重組DNA處理不抗Amp和Tet的受體細胞，先在只含Amp的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結果是含重組DNA或只含克隆載體的受體細胞均能長成菌落(藻落或細胞團)。隨后從每個菌落取一部分再接種在含Tet的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能繼續(xù)生長的是被克隆載體轉化的克隆子，而含目的基因的重組DNA轉化的受體細胞不能生長。據(jù)此可以從原來仍保留的系列菌落中篩選出含目的基因的真正克隆子。2. 利用乳糖操縱子利用乳糖操縱子1ac Z基因篩選克隆子基因篩選克隆子 具

27、完整乳糖操縱子的菌體能翻譯 -半乳糖苦酶(Z)、透性酶(Y)和乙?；D移酶(A)，當培養(yǎng)基中含有X-gal(5-溴4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代- -D半乳糖苷) 時，可產(chǎn)生藍色沉淀，使菌落成藍色。如含乳糖操縱子缺陷型 (lac Z )的載體轉化互補型菌株，在含X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，克隆子是藍色菌落，而未轉化的互補型菌株的菌落是白色的。當含目的基因的DNA片段插入lac Z基因區(qū)，即使轉化互補型菌株細胞，在含X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中，也是長出白色的菌落。由此可以根據(jù)茵落的藍、白顏色篩選出含目的基因的克隆子。為區(qū)分含目的基因的克隆子與未被轉化的受體

28、菌(白色菌落)，可在選擇培養(yǎng)基中添加克隆載體其他選擇標記藥物。三、利用雙酶切片段重組法初篩克隆子三、利用雙酶切片段重組法初篩克隆子 在無法利用克隆載體選擇標記的情況下，可以考慮采用雙酶切片段重組法。根據(jù)實驗設計，選用兩種限制性內切酶切割載體DNA分子，用凝膠電泳回收兩端具不同粘性末端的線形載體DNA，并經(jīng)堿性磷酸酶處理后，與同樣用那兩種限制性內切酶切割獲得的含目的基因的DNA片段連接，轉化受體細胞，在含克隆載體選擇標記藥物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出的菌落絕大部分是含目的基因的克隆子。因為如此處理的克隆載體DNA不能自行環(huán)化，只有同具有相同粘性末端的含目的基因的DNA片段連接成環(huán)狀DNA分子，才能有效

29、地轉化受體細胞。但不排除有少量線形的克隆載體DNA轉化的受體細胞，長出只含載體的克隆子。四、利用報告基因篩選克陷子四、利用報告基因篩選克陷子 對于那些不宜用克隆載體選擇標記篩選克隆子的受體細胞，往往在含目的基因的DNA片段與克隆載體連接之前，先在目的基因上游或下游連接一個報告基因。這樣的重組DNA導人受體細胞后，可根據(jù)報告基因的表達產(chǎn)物篩選克隆子。常用的報告基因有GUS(葡萄糖苷酸酶)基因和LUC(熒光素酶)基因，利用這些基因產(chǎn)物催化特定底物的反應產(chǎn)物篩選出克隆子。此外，NPT- (新霉素磷酸轉移酶 )基因和CAT(氯霉素乙?；D移酶)基因也可用作報告基因。五、克隆子的進一步鑒定五、克隆子的進

30、一步鑒定 用上述方法篩選的克隆子，難免得到一些假的克隆子。為進一步鑒定克隆子的真假，可采用限制性內切酶分析、分子雜交、PCR擴增DNA測序等方法。1、限制性內切酶分析法、限制性內切酶分析法 這是一種最簡單也是最常用的方法，從克隆子提取DNA，經(jīng)凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)外DNA帶，可初步認定是克隆子；在此基礎上，回收外源DNA，根據(jù)實驗設計選用一些限制性內切酶切割，進一步用凝膠電泳檢測，如果檢測結果同原來用于轉化的外源DNA被這些酶切割的結果一致，則可認為是真的克隆子。2、分子雜交法、分子雜交法 根據(jù)實驗設計，先制備含目的基因的DNA片段的探針，隨后采用斑點雜交或DNA印跡(southern blo

31、tting)等方法進行鑒定。(1)斑點雜交法斑點雜交法 (2)southern雜交法雜交法3、 PCR法法 根據(jù)含目的基因兩端或兩側已知核昔酸序列，設計合成一對引物，以待鑒定的克隆子的DNA為模板進行擴增，若獲得特異性擴增DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子。此方法的優(yōu)點是靈敏、快速，并且可證實是完整的目的基因。而采用DNA分子雜交的方法，只要在被雜交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就會出現(xiàn)雜交信號。4、 DNA測序法測序法 以上方法可斷定克隆子含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作過程中是否發(fā)生了變化。為此還必須進行目的基因的核苷酸測序。如果待測序的目的基因比較大，測序有困難，也可用RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術。用限制性內切酶對待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進行切割，若凝膠電泳結果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。經(jīng)多種限制性內切酶切割分析，若兩者結果都一樣，可認為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒有變化。5、目的基因轉錄產(chǎn)物檢測、目的基因轉錄產(chǎn)物檢測 通過克隆子篩選和鑒定，證實含目的基因的DNA片段已隨克隆載體進入受體細胞，以不同方式進