生物技術(shù)概論

1、生生 物物 技技 術(shù)術(shù) 概概 論論東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 李李 杰杰緒緒 論論一、生物技術(shù)的定義 生物技術(shù)(biotechnology),也稱生物工程(bioengineering)，是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，接合先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品。 生物技術(shù)是有多學(xué)科綜合而成的一門新學(xué)科。二、生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系二、生物技術(shù)的種類及其相互關(guān)系生物技術(shù)主要包括以下生物技術(shù)主要包括以下5項技術(shù)：項技術(shù)：1.基因工程（gene engineering）2.細(xì)胞工程（cell engineering）3.酶工程（enz

2、yme engineering）4.發(fā)酵工程（fermentation engineering）5.蛋白質(zhì)工程（protein engineering ）1.基因工程（基因工程（gene engineering） 基因工程是70年代興起的一門新技術(shù)，其主要原理是應(yīng)用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)，通常是DNA分離出來，在體外進(jìn)行切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA導(dǎo)入某種宿主細(xì)胞或個體，從而改變它們的遺傳品性；有時還使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個體中大量表達(dá)，以獲得基因產(chǎn)物。也稱DNA重組技術(shù)。2.細(xì)胞工程（細(xì)胞工程（cell engineering） 所謂細(xì)胞工程是指以細(xì)胞為基本單位，在體外條

3、件下進(jìn)行培養(yǎng)、反之，或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動、植物個體，或獲得某種有用物質(zhì)的過程。包括動、植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞器移植技術(shù)等。3.酶工程（酶工程（enzyme engineering 所謂酶工程是利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能，或?qū)γ高M(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術(shù)。包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞的固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計等技術(shù)。 4.發(fā)酵工程發(fā)酵工程（fermentation engineering） 利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝

4、過程特殊等優(yōu)點，在合適條件下，通過現(xiàn)代工程技術(shù)手段，由微生物的某種特定功能生產(chǎn)出人類所需的產(chǎn)品稱為發(fā)酵工程，也稱微生物工程。 5.蛋白質(zhì)工程（蛋白質(zhì)工程（protein engineering ） 是指在基因工程的基礎(chǔ)上，接合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、計算機(jī)輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定向改造，從而達(dá)到對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、拼接以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)。這這5項技術(shù)是互相聯(lián)系、互相滲透的項技術(shù)是互相聯(lián)系、互相滲透的三、生物技術(shù)涉及的學(xué)科三、生物技術(shù)涉及的學(xué)科 現(xiàn)代生物技術(shù)是所有自然科學(xué)領(lǐng)域中涵蓋范圍最廣的學(xué)科之一。它包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫生物學(xué)、人

5、體生理學(xué)、動物生理學(xué)、植物生理學(xué)、微生物生理學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)等幾乎生物科學(xué)所有的次級學(xué)科，又結(jié)合了化學(xué)、化學(xué)工程學(xué)、數(shù)學(xué)、微電子技術(shù)、計算機(jī)科學(xué)等尖端基礎(chǔ)學(xué)科，是一門多學(xué)科互相滲透的綜合性學(xué)科。四、生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響四、生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響1.改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺。改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺。1.1提高農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)（1）培育抗逆的作物優(yōu)良品系；（2）植物種苗的工廠化生產(chǎn)；（3）提高糧食品質(zhì)；（4）生物固氮，減少化肥用量。1.2發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)（1）動物的大量快速無性繁殖；（2）培育動物的優(yōu)良品系。轉(zhuǎn)基因技術(shù)與轉(zhuǎn)基因生物

6、轉(zhuǎn)基因技術(shù)與轉(zhuǎn)基因生物 通過基因工程技術(shù)對生物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，使生物體獲得新的優(yōu)良品性，稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的生物體稱之為轉(zhuǎn)基因生物。四、生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響四、生物技術(shù)對經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的影響2.提高生命質(zhì)量，延長人類壽命提高生命質(zhì)量，延長人類壽命 （1）開發(fā)新型藥品 （2）疾病的預(yù)防和診斷 （3）基因治療 （4）人類基因組計劃（HGP） 3.解決能源危機(jī)，治理環(huán)境污染解決能源危機(jī)，治理環(huán)境污染 （1）解決能源危機(jī) （2）環(huán)境保護(hù) 4.制造工業(yè)原料，生產(chǎn)貴重金屬制造工業(yè)原料，生產(chǎn)貴重金屬 （1）制造工業(yè)原料 （2）生產(chǎn)貴重金屬五、發(fā)展生物技術(shù)的重要性五、發(fā)展生物技術(shù)的重要性

7、1.生物技術(shù)是解決全球性經(jīng)濟(jì)問題的關(guān)鍵技術(shù)。2.生物技術(shù)促進(jìn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)改造和新興產(chǎn)業(yè)的形成，對人類社會生活將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的革命性的影響。 生物技術(shù)將是生物技術(shù)將是2121世紀(jì)高新技術(shù)革命的核心世紀(jì)高新技術(shù)革命的核心內(nèi)容，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將是內(nèi)容，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將是2121世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。第二章第二章 基因工程基因工程l基因工程的基本含義 ： l 按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造生物特性，使現(xiàn)有物種在較短的時間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造新的生物類型。第一節(jié)第一節(jié) 基因工程工具酶和基因工程工具酶和DNA加工加工 一般把DNA分子切割、 DNA片段末端修飾

8、和DNA片段連接等所用的酶稱為工具酶。一、限制性內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）是一類一環(huán)狀或線形DNA為底物，能識別DNA種特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下斷開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生具有3?1OH和5 ?1P基團(tuán)DNA片段的內(nèi)脫氧核苷酸酶。目前基因工程中所用的是II型酶。1.限制性內(nèi)切酶在限制性內(nèi)切酶在DNA分子上的識別順序分子上的識別順序 限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA分子上能識別的特定核苷酸序列稱之為識別序列，也稱識別位點。識別序列多數(shù)由4、5、6個核苷酸組成，其共同特點是呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱。2.限制性內(nèi)切酶切割限制性內(nèi)切酶切割DNA的位點和切

9、割片段的末端的位點和切割片段的末端 II型限制性內(nèi)切酶的切割位點位于識別序列區(qū)內(nèi)，不同的酶切割DNA分子后所產(chǎn)生的末端不同。 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不同，但切割DNA分子產(chǎn)生的DNA片段具有相同的末端，稱之為同尾酶。二、二、DNA連接酶連接酶 能催化兩個DNA片段末端之間-P和-OH基團(tuán)形成磷酸二酯鍵，是兩個末端連接的酶稱為DNA連接酶（DNA ligase）.現(xiàn)用的DNA連接酶有兩種：（1）E.coli DNA 連接酶；（2）T4 DNA連接酶三、三、DNA片段末端修飾酶片段末端修飾酶1.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶2.核酸外切酶3.堿性磷酸酶第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆載體基因克隆載體 一般而言，

10、外源基因必須先同某種傳遞者結(jié)合后才能進(jìn)入細(xì)菌和動植物受體細(xì)胞，把這種能承載外源DNA片段(基因)帶入受體細(xì)胞的傳遞者稱之基因克隆載體(gene cloning vector)。 作為基因克隆載體至少必須具備3個條件：(1)具有能使外源DNA片段組人的克隆位點。(2)能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，或游離在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制。(3)必須具有選擇標(biāo)記，承載外源DNA的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，以便篩選克隆子。一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體是最早發(fā)展起來的一類基因克隆載體，以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，是微生物和植物轉(zhuǎn)基因研究的主要載體。 質(zhì)粒是細(xì)胞中染

11、色體外的裸露DNA分子，廣泛存在于細(xì)菌之中，在某些藍(lán)藻、綠藻和真菌細(xì)胞中也存在質(zhì)粒。一個質(zhì)粒就是一個DNA分子，多數(shù)以超螺旋環(huán)狀共價雙鏈分子形式存在，以ccDNA表示，體外在理化因子作用下可成為開環(huán) 或線形分子。構(gòu)建質(zhì)粒載體一般選用分子小和松弛型復(fù)制的質(zhì)粒。至今已構(gòu)建了不下幾百種的質(zhì)粒載體，現(xiàn)舉例如下：1.pBR3222.pUC18/19二、噬菌體和病毒載體二、噬菌體和病毒載體1. cosmid載體 由帶cos位點的 DNA片段與質(zhì)粒構(gòu)建的載體稱之為cosmid載體。2.CaMV基因克隆載體（1）互補(bǔ)載體系統(tǒng)（2）混合載體系統(tǒng)（3）CaMV35S啟動子融合基因載體系統(tǒng)第三節(jié)第三節(jié) 目的基因?qū)?/p>

12、受體細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞一、 受體細(xì)胞 所謂基因克隆的受體細(xì)胞，從實驗技術(shù)上講是能攝取外源 nNA(基因)并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用 價值和理論研究價值的細(xì)胞。原核生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞可以作為受體細(xì)胞。1.原核生物細(xì)胞原核生物細(xì)胞 原核生物細(xì)胞是一類很好的受體細(xì)胞，容易攝取外界的DNA，增殖快，基因組簡單，便于培養(yǎng)和基因操作，普遍被用作cDNA文庫和基因組文庫的受體菌，或者用來建立生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物的工程菌，或者作為克隆載體的宿主。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍(lán)藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應(yīng)用。2.真核生物細(xì)胞真核生物細(xì)胞 真核生物細(xì)胞作為基因克隆受體近來

13、已受到很大的重視。1.酵母酵母：由于某些性狀類似原核生物，所以較早就被用作基因克隆受體。2.動物細(xì)胞動物細(xì)胞：也已被用作受體細(xì)胞，但由于體細(xì)胞不易再分化成個體，所以采用生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞，由此培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因動物。不過最近通過體細(xì)胞培養(yǎng)出了多種克隆動物，由此可見動物體細(xì)胞同樣可以用作基因克隆的受體細(xì)胞。3.植物細(xì)胞植物細(xì)胞：作為基因克隆的受體細(xì)胞，有其優(yōu)于動物細(xì)胞的特點，一個活的離體體細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下比較容易再分化成植株，意味著一個獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)成能傳代的植株，成為轉(zhuǎn)基因植物。由于這個原因，近年來植物基因工程發(fā)展非常迅速。二、目的基因組入克隆載體

14、二、目的基因組入克隆載體 目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，一般須先把含目的基因的DNA片段組入合適的克隆載體。為選用合適的克隆載體，必須注意以下幾點：為了使組入的目的基因能夠在受體細(xì)胞中有效表達(dá)，應(yīng)選用具強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體。根據(jù)確定的受體系統(tǒng)，選用相應(yīng)的克隆載體，因為用作受體細(xì)胞的不同生物類型有各自適用的克隆載體。選用的克隆載體應(yīng)是便于同含目的基因的DNA片段進(jìn)行連接。 根據(jù)實驗設(shè)計，有了合適的克隆載體和含目的基因的DNA片段，則選用限制性內(nèi)切酶切割，并用DNA連接酶連接，得到預(yù)期的重組DNA分子。三、重組三、重組DNA分子導(dǎo)入原核生物細(xì)胞分子導(dǎo)入原核生物細(xì)胞 可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和三親本雜交等途徑，

15、 把重組DNA分子導(dǎo)入原核生物細(xì)胞。1.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 化化 攜帶基因的外源DNA分子通過與膜結(jié)合進(jìn)人受體細(xì)胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的技術(shù)路線包括制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化處理。 感受態(tài)細(xì)胞指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。2.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 導(dǎo)導(dǎo) 通過噬菌體(病毒) 顆粒感染，把DNA導(dǎo)入被感染的受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。含目的基因的DNA與噬菌體(病毒)載體的重組DNA分子導(dǎo)人受體細(xì)胞，一般先須進(jìn)行體外包裝。為此，根據(jù)噬菌體體內(nèi)包裝的原理，獲得了分別缺D蛋白和E蛋白入噬菌體突變株的兩種溶源菌。這兩種溶源重菌單獨培

16、養(yǎng)，因各缺一種包裝必備的蛋白質(zhì)，所以體內(nèi)即使有 DNA也不能進(jìn)行包裝，因此細(xì)胞內(nèi)積累了大量除一種以外的其他供包裝用的蛋白質(zhì)。如果在試管內(nèi)混合兩種溶源菌合成的蛋白質(zhì)，D蛋白和E蛋白互相補(bǔ)充，就可以包裝 DNA或重組的 DNA。3.重組重組重組重組DNA分子通過三親本雜交轉(zhuǎn)分子通過三親本雜交轉(zhuǎn)化大腸桿菌化大腸桿菌 當(dāng)重組DNA分子不能直接轉(zhuǎn)化受體菌時，可采用三親本雜交(triparental mating)轉(zhuǎn)化法。被轉(zhuǎn)化的受體菌、含重組DNA分子的供體菌和含廣泛宿主輔助質(zhì)粒的輔助菌三者進(jìn)行共培養(yǎng)，在輔助質(zhì)粒的作用下，重組DNA分子被轉(zhuǎn)移到受體茵細(xì)胞內(nèi)，按照重組DNA分子攜帶的選擇標(biāo)記篩選克隆子。

17、四、重組四、重組DNA分子導(dǎo)入真核生物細(xì)胞分子導(dǎo)入真核生物細(xì)胞 由于真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，適用于原核生物基因轉(zhuǎn)移的方法不能有效地用于真核生物。近年來經(jīng)過探索，發(fā)展了多種適用于植物和動物轉(zhuǎn)基因的方法。1. 重組重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞分子導(dǎo)入植物細(xì)胞（1）用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 含有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌與一些植物的細(xì)胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一部分 (T- DNA)可以導(dǎo)人植物細(xì)胞，整合到植物基因組中，隨其復(fù)制而復(fù)制。根據(jù)這一特性可構(gòu)建一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的基因的DNA片段重組，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體共培養(yǎng)法和懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)法，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物

18、細(xì)胞。 用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已獲得了一些轉(zhuǎn)基因植物，但是一般局限于雙子葉植物。1. 重組重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞分子導(dǎo)入植物細(xì)胞(2)重組DNA的直接轉(zhuǎn)移法 為克服致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的受體局限性，近來發(fā)展了電穿孔法、微彈轟擊法、激光微束穿孔法、多聚物介導(dǎo)法和花粉管通道法等，把重組DNA分子直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。微彈轟擊法：微彈轟擊法： 金屬微粒在外力作用下達(dá)到一定速度后，可以進(jìn)入植物細(xì)胞，但又不引起細(xì)胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動。利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微粒混勻，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DNA隨高速金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞。此方法可直接處理植物

19、某器官或某組織，是當(dāng)今普遍使用的植物轉(zhuǎn)基因方法。電穿孔法電穿孔法 細(xì)胞膜的基本組成是磷脂，在適當(dāng)?shù)耐饧用}沖電場作用下，細(xì)胞膜被擊穿，但還達(dá)不到細(xì)胞致命傷害。所以當(dāng)移去外加電場后，被擊穿的膜孔可自行復(fù)原。根據(jù)這一性質(zhì)，植物原生質(zhì)體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預(yù)定的參數(shù)進(jìn)行直流電脈沖處理，再通過常規(guī)的再分化培養(yǎng)和篩選，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。為避免制備原生質(zhì)體和原生質(zhì)體再生植株的困難，近來用此技術(shù)享接處理具有完整細(xì)胞壁的植物細(xì)胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。激光微束穿孔法激光微束穿孔法 利用直徑很小、能量很高的激光微束可引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細(xì)胞，

20、處于細(xì)胞周圍的重組DNA隨之進(jìn)入細(xì)胞。此方法最適用于活細(xì)胞中線粒體和葉綠體等細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)移。多聚物介導(dǎo)法多聚物介導(dǎo)法 聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸和多聚鳥氨酸等是協(xié)助DNA轉(zhuǎn)移的常用多聚物，尤以PEG應(yīng)用最廣。這些多聚物同二價陽離子和DNA混合，可在原生質(zhì)體表面形成顆粒沉淀，使DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)?；ǚ酃芡ǖ婪ɑǚ酃芡ǖ婪?將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具有正常細(xì)胞壁的卵、合子和早期的胚胎細(xì)胞，在活體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。 此外還有人使用顯微注射法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。2.重組重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 哺乳動物的細(xì)

21、胞不易從周圍捕獲外源DNA ，明顯地影響了哺乳動物轉(zhuǎn)基因的發(fā)展。近年來通過研究發(fā)展了一系列能有效地將外源DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法，主要有以下幾種。(1)病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 由于病毒的種類繁多，用病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)各異，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程各有不同，主要有三種類型：其一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上；其二，帶有目的基因的病毒基因組是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞；其三，雖然帶有目的基因的病毒基因：組是缺陷型的，但是被感染的受體細(xì)胞的基因組中已整合了病毒缺失的基因，所以沒有必要用輔助病毒混合感染

22、。(2)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 哺乳動物細(xì)胞能捕獲粘附在細(xì)胞表面的DNA磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。先將待轉(zhuǎn)染的重組DNA同CaCl2混合制成CaCl2 -DNA溶液，隨后逐漸緩慢地加入Hepers磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在培養(yǎng)的細(xì)胞表面上，達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。(3)DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖轉(zhuǎn)染法 DEAEdextran(二乙胺乙基葡聚糖)是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源DNA分子。基本操作過程主要有兩種方式：其一，先使病毒的DNA直接同DEAE葡聚糖混合，形成DNADEAE葡聚糖復(fù)合物,再處理受體細(xì)胞；其二，受體細(xì)胞先用DEAE葡聚糖溶液預(yù)處理，

23、隨后再同DNA接觸，也可達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。(4)聚陽離子聚陽離子DMSO(二甲基亞砜二甲基亞砜)處理轉(zhuǎn)染法處理轉(zhuǎn)染法 用聚陽離子(叫ybrene)處理哺乳動物細(xì)胞，使細(xì)胞表面增加對外源DNA的吸附能力，再用25-30 DMSO處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對DNA的捕獲量，達(dá)到有效的轉(zhuǎn)染。(5)脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法 脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，把用來轉(zhuǎn)染的DNA分子包在其中，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸，將外源DNA導(dǎo)人受體細(xì)胞。包裝成脂質(zhì)體的DNA的轉(zhuǎn)染串比裸露的DNA的轉(zhuǎn)染率高出100倍。如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質(zhì)體，可提高轉(zhuǎn)染率1020倍。在正常

24、情況下，每個細(xì)胞平均可吸收1000個左右的脂質(zhì)體。這是哺乳動物轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法之一。(6)顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù) 鑒于哺乳動物細(xì)胞便于注射的特性，常應(yīng)用顯微注射法把外源DNA分子直接注人細(xì)胞。 此外，為便于操作，也可采用“穿刺”法。處于細(xì)胞周圍的DNA隨微針穿刺形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞，或隨穿刺的針頭帶入細(xì)胞。 (7)電穿孔法電穿孔法 其原理和操作過程類似植物細(xì)胞的電穿孔 轉(zhuǎn)移DNA的方法。第四節(jié)、克隆子的篩選和簽定第四節(jié)、克隆子的篩選和簽定 受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)或轉(zhuǎn)導(dǎo)處理后，真正導(dǎo)入目的基因并能有效表達(dá)的克隆子一般來說只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細(xì)胞。為了從處理后的

25、大量受體細(xì)胞中分離出真正的克隆子，已建立了一系列篩選和鑒定的方法，主要有以下幾種。一、利用克隆載體攜帶的選擇標(biāo)記基因一、利用克隆載體攜帶的選擇標(biāo)記基因篩選克隆子篩選克隆子 1.抗菌素抗性基因 2.lacZ基因 1. 利用抗菌素抗性基因進(jìn)行篩選利用抗菌素抗性基因進(jìn)行篩選 不同克隆載體通常分別攜帶不同的抗性基因，如Ampr(抗氨芐青霉素)、Cmpr (抗氯霉素)、Kan r(抗卡那霉素)、Tetr (抗四環(huán)素)和Strr (抗鏈霉素)等。當(dāng)含任何一種抗菌素抗性基因的載體處理不具這種抗性基因的受體細(xì)胞，并在含相應(yīng)抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，只有獲得載體的受體細(xì)胞才能繼續(xù)生長，這樣便可篩選出含克隆載體的克

26、隆子。 要篩選含目的基因的克隆子，可選用具Ampr和Tetr這樣的雙抗選擇標(biāo)記載體，把含目的基因的DNA片段插入其中之一的Tetr選擇標(biāo)記基因區(qū)，導(dǎo)致該基因的插入失活。用這樣的重組DNA處理不抗Amp和Tet的受體細(xì)胞，先在只含Amp的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果是含重組DNA或只含克隆載體的受體細(xì)胞均能長成菌落(藻落或細(xì)胞團(tuán))。隨后從每個菌落取一部分再接種在含Tet的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能繼續(xù)生長的是被克隆載體轉(zhuǎn)化的克隆子，而含目的基因的重組DNA轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞不能生長。據(jù)此可以從原來仍保留的系列菌落中篩選出含目的基因的真正克隆子。2. 利用乳糖操縱子利用乳糖操縱子1ac Z基因篩選克隆子基因篩選克隆子 具

27、完整乳糖操縱子的菌體能翻譯 -半乳糖苦酶(Z)、透性酶(Y)和乙?；D(zhuǎn)移酶(A)，當(dāng)培養(yǎng)基中含有X-gal(5-溴4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷)和IPTG(異丙基硫代- -D半乳糖苷) 時，可產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落成藍(lán)色。如含乳糖操縱子缺陷型 (lac Z )的載體轉(zhuǎn)化互補(bǔ)型菌株，在含X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，克隆子是藍(lán)色菌落，而未轉(zhuǎn)化的互補(bǔ)型菌株的菌落是白色的。當(dāng)含目的基因的DNA片段插入lac Z基因區(qū)，即使轉(zhuǎn)化互補(bǔ)型菌株細(xì)胞，在含X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中，也是長出白色的菌落。由此可以根據(jù)茵落的藍(lán)、白顏色篩選出含目的基因的克隆子。為區(qū)分含目的基因的克隆子與未被轉(zhuǎn)化的受體

28、菌(白色菌落)，可在選擇培養(yǎng)基中添加克隆載體其他選擇標(biāo)記藥物。三、利用雙酶切片段重組法初篩克隆子三、利用雙酶切片段重組法初篩克隆子 在無法利用克隆載體選擇標(biāo)記的情況下，可以考慮采用雙酶切片段重組法。根據(jù)實驗設(shè)計，選用兩種限制性內(nèi)切酶切割載體DNA分子，用凝膠電泳回收兩端具不同粘性末端的線形載體DNA，并經(jīng)堿性磷酸酶處理后，與同樣用那兩種限制性內(nèi)切酶切割獲得的含目的基因的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，在含克隆載體選擇標(biāo)記藥物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出的菌落絕大部分是含目的基因的克隆子。因為如此處理的克隆載體DNA不能自行環(huán)化，只有同具有相同粘性末端的含目的基因的DNA片段連接成環(huán)狀DNA分子，才能有效

29、地轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。但不排除有少量線形的克隆載體DNA轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，長出只含載體的克隆子。四、利用報告基因篩選克陷子四、利用報告基因篩選克陷子 對于那些不宜用克隆載體選擇標(biāo)記篩選克隆子的受體細(xì)胞，往往在含目的基因的DNA片段與克隆載體連接之前，先在目的基因上游或下游連接一個報告基因。這樣的重組DNA導(dǎo)人受體細(xì)胞后，可根據(jù)報告基因的表達(dá)產(chǎn)物篩選克隆子。常用的報告基因有GUS(葡萄糖苷酸酶)基因和LUC(熒光素酶)基因，利用這些基因產(chǎn)物催化特定底物的反應(yīng)產(chǎn)物篩選出克隆子。此外，NPT- (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 )基因和CAT(氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶)基因也可用作報告基因。五、克隆子的進(jìn)一步鑒定五、克隆子的進(jìn)

30、一步鑒定 用上述方法篩選的克隆子，難免得到一些假的克隆子。為進(jìn)一步鑒定克隆子的真假，可采用限制性內(nèi)切酶分析、分子雜交、PCR擴(kuò)增DNA測序等方法。1、限制性內(nèi)切酶分析法、限制性內(nèi)切酶分析法 這是一種最簡單也是最常用的方法，從克隆子提取DNA，經(jīng)凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)外DNA帶，可初步認(rèn)定是克隆子；在此基礎(chǔ)上，回收外源DNA，根據(jù)實驗設(shè)計選用一些限制性內(nèi)切酶切割，進(jìn)一步用凝膠電泳檢測，如果檢測結(jié)果同原來用于轉(zhuǎn)化的外源DNA被這些酶切割的結(jié)果一致，則可認(rèn)為是真的克隆子。2、分子雜交法、分子雜交法 根據(jù)實驗設(shè)計，先制備含目的基因的DNA片段的探針，隨后采用斑點雜交或DNA印跡(southern blo

31、tting)等方法進(jìn)行鑒定。(1)斑點雜交法斑點雜交法 (2)southern雜交法雜交法3、 PCR法法 根據(jù)含目的基因兩端或兩側(cè)已知核昔酸序列，設(shè)計合成一對引物，以待鑒定的克隆子的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若獲得特異性擴(kuò)增DNA片段，表明待鑒定的克隆子含有目的基因，是真的克隆子。此方法的優(yōu)點是靈敏、快速，并且可證實是完整的目的基因。而采用DNA分子雜交的方法，只要在被雜交的DNA中存在目的基因的一部分DNA序列，就會出現(xiàn)雜交信號。4、 DNA測序法測序法 以上方法可斷定克隆子含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列在一系列操作過程中是否發(fā)生了變化。為此還必須進(jìn)行目的基因的核苷酸測序。如果待測序的目的基因比較大，測序有困難，也可用RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)。用限制性內(nèi)切酶對待克隆的目的基因和已克隆的目的基因進(jìn)行切割，若凝膠電泳結(jié)果不一致，可斷定克隆子中克隆的不是目的基因，或者克隆的目的基因的核苷酸序列已發(fā)生了變化。經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶切割分析，若兩者結(jié)果都一樣，可認(rèn)為克隆子中克隆的是原定的目的基因，其核苷酸序列沒有變化。5、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 通過克隆子篩選和鑒定，證實含目的基因的DNA片段已隨克隆載體進(jìn)入受體細(xì)胞，以不同方式進(jìn)