引物二聚體的形成

1、什么是引物二聚體怎樣消除引物二聚體是引物的 3'端間相互錯(cuò)配擴(kuò)增形成的。 引物二聚體的出現(xiàn)是必然的， 只是或多或 少的問(wèn)題， 電泳時(shí)看不到引物二聚體帶也不代表沒(méi)有二聚體出現(xiàn)， 只是含量低我 們 的肉眼看不到而已。提高 PCR嚴(yán)謹(jǐn)性（包括提高退火溫度，降低引物濃度等） 可大大降低二聚體的濃度。減少PCR產(chǎn)物中引物二聚體的方法：1從引物自身 著手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問(wèn)題的辦法 ;2.可能模板有問(wèn)題 ;模板濃度過(guò)小，適當(dāng)加大模板量 ;酶，引物，Mg2+濃度可能過(guò)高，可 降低它們的濃度；4.取你所要加的上下游引物混合后，在 100 攝氏度下的沸水中煮 5分鐘，然后迅 速拿出至于冰

2、塊之上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引 物二聚體就會(huì)消 失的 ；理由：引物可能會(huì)發(fā)生發(fā)夾結(jié)構(gòu) ,自身環(huán)化等結(jié)構(gòu) ,在 100 攝氏度下的沸水中 煮5分鐘可使引物變?yōu)閱捂湥詼p少二聚體。不過(guò)有人認(rèn)為在 PCR儀上95度變 性 5min 也同樣達(dá)到目的，而且成功試過(guò)通過(guò)延長(zhǎng)退火時(shí)間也可以消除引物二聚 體。5所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可 以增強(qiáng)特異性；反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加TAq酶，PCR結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下 過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些TAQ酶會(huì)將多余的引物合成為二聚體。7. 增加循環(huán)數(shù) ；8. 降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減

3、少， 則考慮增加鎂離子濃度 （根據(jù)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度 而定，片段長(zhǎng)則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該 高一些 ）；9. 若降低退火溫度， 發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體， 而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l 沒(méi)有區(qū)別，則考慮 Buffer 等試劑沒(méi)有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不 對(duì)。10. 以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR可以提高引物與模板的特異性，減少引 物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋1001000倍，如果間 隔較長(zhǎng)可以稀釋50100倍。反應(yīng)成分問(wèn)題:可能的原因解決辦法引物3'端互補(bǔ)重新設(shè)計(jì)引物引物長(zhǎng)度過(guò)短增大引物長(zhǎng)度引物濃度太高降低引物濃度模板濃度太低提高模板濃度反應(yīng)條件

4、問(wèn)題:可能的原因解決辦法退火溫度不夠優(yōu)化優(yōu)化退火溫度循環(huán)數(shù)太多減少循環(huán)數(shù)如何區(qū)分引物二聚體與 PCR產(chǎn)物(100kb)(1). PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)可能出現(xiàn)那些問(wèn)題：一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性， 酶的質(zhì)量及，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)， 模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消

5、化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱， 是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理 想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做P

6、CR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異 性，濃度過(guò)低則影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用的體積為 20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用 多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模

7、索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn) 假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合， 或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。弓I物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行

8、PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式 PCR方法來(lái)減輕

9、或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93 C變性，65 C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀

10、帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減 少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低 Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。（2）。怎么鑒別引物二聚體和產(chǎn)物：1. 實(shí)時(shí)定量PCRPCR可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過(guò)對(duì)光密度掃描來(lái)進(jìn)半定量的分析。無(wú)論定性還是半定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng) PCR 信號(hào)放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一特定基因在特定組織

11、中的表達(dá)量。早期定量PCR技術(shù)需要特別的訓(xùn)練，嚴(yán)格的測(cè)試和特別準(zhǔn)確的加樣。早期定量PCR技術(shù)的難點(diǎn)主要在于：如何確定 PCR正處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號(hào)才與初始模板的拷貝數(shù)成比例），為了保證線性，研究者要擴(kuò)增一系列梯度稀釋的cDNA或者對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。所謂的實(shí)時(shí)熒光定量PCR其反應(yīng)體系中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線（如圖1 ）。一般而言

12、，熒光擴(kuò)增曲線可以分三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段， 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物 量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量 與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置

13、上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT值（threshold value ）（如圖2所示）。定量熒光擴(kuò)增曲線是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表。熒光閾值線的位置一般事實(shí)上位于減去本底的位置上，這時(shí)的熒光信號(hào)超過(guò)了熒光背景信號(hào)并且開(kāi)始增加。對(duì)某一樣品的C（ t）值就定義為熒光量與熒光閾值線交叉時(shí)的循環(huán)數(shù)。CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表CT值，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的

14、對(duì)數(shù)（如圖 3所示）。因些只要獲得未知樣品 的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。SYBR Green I熒光染料目前熒光實(shí)時(shí)定量 PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：內(nèi)嵌染料（SYBR GreenI）、雙標(biāo)記探針、FRET探針、分子信標(biāo)和 Ampliflor。其中SYBR Green I染料法不需要設(shè) 計(jì)合成序列特異性探針和新的引物對(duì)，是一種簡(jiǎn)便，性價(jià)比較高的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法， 常常被用于進(jìn)行RNA表達(dá)相對(duì)定量以及 DNA定量研究中。SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。

15、SYBR Green I的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm,發(fā)射波長(zhǎng)最大約為 520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量 SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料特異性地?fù)饺?DNA雙鏈后，發(fā)射強(qiáng)熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子僅有微 弱熒光信號(hào)背景，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步。SYBR Greenl在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特 異擴(kuò)增。此外，由于一個(gè) PCR產(chǎn)物可以與多個(gè)分子的染料結(jié)

16、合，因此SYBR Greenl的檢測(cè)靈敏度很高。但是，由于 SYBR Greenl與所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單 鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由熔解曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析 SYBR Greenl Real-Time PCR定量結(jié)果。在PCR結(jié)束后，我們可以根據(jù)變性過(guò)程中的熒光值變化繪出每個(gè)樣品的熔解曲線。繪制熔 解曲線時(shí)，Real-Time PCR儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品在從雙鏈完全配對(duì)到完全解鏈的升溫過(guò)和中 熒光值的變化過(guò)程。不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)槠溟L(zhǎng)度和GC含量不同而在不一樣

17、的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時(shí)，SYBR Greenl的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測(cè)到。由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度 變化的負(fù)一次倒數(shù)圖。熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)（熔點(diǎn)，Tm）即為熔解峰值。熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，當(dāng)圖中沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，我們可以對(duì)DNA、RNA 樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定是量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外我們不定期可以對(duì)P

18、CR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析：例如利用熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體。以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測(cè)等。目前實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及 藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面：1、 比較經(jīng)過(guò)不處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等）， 及特定基因在不同相的表達(dá)差異。2、 比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達(dá)量差異。3、驗(yàn)證基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4、驗(yàn)證RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. DXY上的建議：1 .可以用非變性PAGE膠電泳，應(yīng)該能分開(kāi)的，理論上說(shuō)分辨率達(dá)到1個(gè)堿基?？梢杂梅亲冃员?/p>

19、烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離鑒定®NA在丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍：丙烯酰胺（W/V）:12%有效分離范圍（bp）:40-20015% 25-150電壓一般是1-8V/cm, 6個(gè)小時(shí)后銀染即可分辨你的兩個(gè)片段2. 可以用%TAE的長(zhǎng)膠，在30伏的電壓下（中號(hào)電泳槽），跑16-20小時(shí)是應(yīng)該可以分開(kāi) 的。3. 用的瓊脂糖就能分開(kāi)，我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常用它來(lái)分開(kāi)相差28bp的片段，效果很好，看 的很清楚，但有幾點(diǎn)要注意，緩沖液要是新配的，電壓100v跑10分鐘，接著50v跑一個(gè) 半 小時(shí)，到兩個(gè)小時(shí)。4. 理論上用或者瓊脂糖應(yīng)該都可以分開(kāi)，在電泳的時(shí)候電壓不適宜太大，用40-50V跑上2小時(shí)左右

20、應(yīng)該就可以了。電壓加大到80v或者100v的時(shí)候雖然節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，但是有時(shí)條帶的效果看起來(lái)就不是很好。還有就是似乎你的Marker選擇的不好，即使電泳能夠分開(kāi)兩條帶，這個(gè) Marker也很難來(lái)說(shuō)明你的目的條帶和內(nèi)參帶的大小。5. 用聚丙烯酰胺跑垂直電泳。1。需要單獨(dú)的垂直電泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝膠。2，具體的做法可以到生物谷網(wǎng)站，有詳細(xì)的說(shuō)明。3，你可以用5%的瓊脂糖跑一下。6. 建議你跑PCR的時(shí)候做個(gè)陰性對(duì)照，只加引物，電泳時(shí)看陰性對(duì)照引物二聚體的位置，以區(qū)分?jǐn)M訂目的片段 71bp條帶，或是電泳時(shí)直接加一空引物做對(duì)照1材料與方法1. 1 標(biāo)本人單核細(xì)胞系 U937，細(xì)胞密度2X 108/

21、L分對(duì)照組(N)、處理I組(T1)、處理H組(T 2),N 用 1640 培養(yǎng)基及 10%胎牛血清培養(yǎng)， T1 用 IFN-y 104U/L LPS 1 、T/L用 IFN- 丫 10 U/L LPS 10卩g/分別刺激7 h。1. 2主要試劑與儀器TRIzol 試劑(GIBCO BRL、Fluoro DD 試劑盒(Genomyx)、Supersript n 逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL) Ampli Taq DNA 聚合酶(GIBCO BRL) RNase-free DNasel(Promega);Genomyx LR、 Genomyx SC DNAThermal Cycler(Perkin

22、 Elmer)1. 3 總RNA的制備按試劑盒提供的方法分別提取三種細(xì)胞的總RNA,以RNase-free DNase 1(終濃度80 000U/L)除去其中污染的 DNA,經(jīng)甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度1. 4 mRNA差異顯示.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)選擇錨定引物T7(dT12)AP(anchored prime rs , AP)，序列為5' ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTM其中 M = A/G/C. N= A /G/C/T:,以總 RNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每管反應(yīng)體系如下：總RNA I. 0卩g,AP 4 pmol ,70C

23、5 min,加入50mmol/L Tris- HCl,75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25, dNTRali/x(1 : 1 ： 1 :1), SuperScript n 60 Un its，總反應(yīng)體系 20 卩。42 C 5 min , 50 C 50 min, 70 °C 15 min。1. 4. 2熒光標(biāo)記差異顯示 PCR 選取與逆轉(zhuǎn)錄引物序列相同的帶熒光物質(zhì)標(biāo)記的錨定引物TMR-T7(dT12)AP，隨機(jī)引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG,3'以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 為模板，進(jìn)行 PCR反

24、應(yīng)。反應(yīng)體系包括：20 mmol/L Tris-HCI(pH8 . 4) , 50 mmol/L KCl, 3. 75 mmol/L MgCl2，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 3. 0 仏 150 卩 mol/L dNTP mi x(1 1 : 1), 0. 35 卩 mol/L 5隨機(jī)引 物,0. 35 卩 mol/L 3錨定引物，Ampli Taq U nits，總反應(yīng)體系 10 pl95C 2 min。 94C 15 s, 50C 30 s, 72 C 2 min , 4 個(gè)循環(huán)； 94C 15 s, 60C 30 s, 72 C 2 min , 25 個(gè)循環(huán)；72 C 延伸7 min。1. 4. 3分離

25、差異顯示片段 配制5. 6%變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚 0. 2 5 mm,大 小61 X 33 cm 將PCR產(chǎn)物加4. 0 上樣緩沖液，95C變性后上樣。 3000V、100 W、55 C 電泳4. 5 h。干膠后置于 Genomyx SC掃描，用系統(tǒng)所帶的 AcquireSC program軟件分 析處 理掃描結(jié)果。1. 4. 4回收差異條帶用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手術(shù)刀片切割下所需條帶，置于 30卩1離子水中，37 C水浴3060 min，備用。1. 4. 5差異條帶的再擴(kuò)增以經(jīng)上述處理的回收條帶為模板，T7啟動(dòng)子22-mer(5'GTAATACGACTC

26、ACTATAGGGC3')反 M13(-48)24-mer(5 ' AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')為引物，進(jìn)行再擴(kuò)增反應(yīng)：模板 卩 1,20 mmol/L Tri&HCI(pH8. 4), 50 mmol/L KCl, 1. 5 mmol/L MgCI2,20 卩 MOJ dNTP mix(1 : 1 ： 1 ： 1), 0. 2 卩 mpf L T7、0 . 2 卩 moI/L M13, AmpIiTaq 1 . 0 U nits，總反應(yīng)體系20卩1反應(yīng)條件同差異顯示PC R。2結(jié)果2. 1 總RNA的質(zhì)量總RNA經(jīng)Dnase I處理

27、，用1. 0%甲醛變性凝膠電泳，可見(jiàn)清楚的28 S、18 S 5 S條帶，且28 S/18 S約為2 : 1(圖1),表明RNA完整性好，無(wú)降解現(xiàn)象。N、T1、T2的OD260/OD280比值分別為1 . 92、1 . 83、1 . 98,表明樣品純度高。Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel2. 2 熒光標(biāo)記 mRNA差異顯示結(jié)果顯示每一泳道均有約50條大小不等的擴(kuò)增產(chǎn)物，各組間比較見(jiàn)較多呈有無(wú)或強(qiáng)弱變化的差異條帶，圖2中箭頭所示。2. 3差異條帶再擴(kuò)增取T2中約1 . 25Kb的條帶再擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖 3。熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)通過(guò)對(duì)引物設(shè)

28、計(jì)、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標(biāo)記物的改進(jìn)，極大減少了上述不足。差異顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡(jiǎn)并或非簡(jiǎn)并的雙堿基錨定引物等多種類型，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用雙堿基錨定引物，將總mRNA群體分為12個(gè)亞群，這極大減小了每一錨定引物產(chǎn)生的第一條cDNA鏈的數(shù)量，不僅可降低隨機(jī)引物的用量，更可降低DD產(chǎn)物的復(fù)雜性，使差 示條帶在序列膠上易于分辨，從而傳統(tǒng)方法中常見(jiàn)的重疊帶”現(xiàn)象減少。DD專用的隨機(jī)引 物的特點(diǎn)為A+T與G+C含量近乎相等，且3'-端以G或C結(jié)尾，可增加DD擴(kuò)增的 效率。通過(guò)改 變RT-PCR反應(yīng)條件如底物濃度、延伸時(shí)間等，差異片段的長(zhǎng)度可達(dá) 1. 01. 5kb(圖2),因

29、較長(zhǎng)的cDNA片段容易通過(guò) Northern blot進(jìn)行分析鑒定辨別真假陽(yáng)性克隆，且 其中可提供 更多的序列信息，故獲取大的片段具有重要的意義。文獻(xiàn)認(rèn)為差異顯示居高不下的假陽(yáng)性率實(shí)際上因再擴(kuò)增所致4。通常， 再擴(kuò) 增的引物與DD引物相同，本試驗(yàn)將再擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)為T7(22-mer)與M13-r(24-mer)，此為 在錨定引物的5'端和隨機(jī)引物的3'端分別增加的序列(本文方法中所列差異顯示引物序列的劃線部分)，這兩種來(lái)源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)。同時(shí)，T7啟動(dòng)子序列可直接用于體外轉(zhuǎn)錄合成CRNA探針，為CDNA片段的直接測(cè)序和鑒定（R

30、PA或Northern分析）提供了方便。用常規(guī)的序列分析膠進(jìn)行分辨時(shí)，較長(zhǎng)的cDNA片段往往擠在膠的上端而影響分辨率。本操作改用5 . 6%的PAGE膠（聚丙烯酰胺），減少膠的厚度（僅250卩m）通過(guò)提高電泳的電壓 （3000 V）及溫度（55 C ），可顯著提高分辨率。同位素標(biāo)記存在曝光時(shí)間長(zhǎng)、帶型不佳，基本與相鄰的帶混合、污染等缺點(diǎn)，將熒光物質(zhì)標(biāo)記于錨定引物的 5'端，可產(chǎn)生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期僅兩天。目前，DD技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于與疾病、衰老、生殖、生長(zhǎng)發(fā)育、分化等生理5、病理過(guò)程相關(guān)的未知表達(dá)基因的研究，相信對(duì)揭示生物界基因表達(dá)調(diào)控的奧秘將起重要的作用。軍隊(duì)九五

31、”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助課題 （96M145）7.（附）：凝膠電泳程序：凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種一、瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物根據(jù)瓊脂糖的溶解溫度，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為 6265C,溶解后在 37C下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主 要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連 接等（一 ）凝膠濃度凝膠濃度的選擇依 DNA分子的大小而定 瓊脂糖凝膠的濃度與 DNA分離范圍 瓊脂糖濃度（）線型DNA分子的分離范圍（Kb）560120107632（二）電泳

32、緩沖液核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE和 Tris-磷酸（TPE）.TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但 TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TBE緩沖液中的EDTA可螯合 二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制 DNA酶的活性，防止 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解.10XTBE緩沖液的配制Tris 鹼，108 克EDTA 克硼酸，55克H20 至，1000ul（其PH應(yīng)為臨用時(shí)用水稀至（20倍稀釋.（三）核酸電泳的指示劑與染色劑1指示劑：核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭

33、色，在、1%、和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、和的雙鏈線性DNA片段大致相同二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在1%和瓊脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和的雙鏈線性DNA大致相似指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液載樣緩沖液的作用有增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便染色劑:核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色溴化乙錠（ethidium bromide ,鈔是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下

34、，發(fā)出紅色熒光根據(jù)情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為ml的EB,有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min.瓊脂 糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其 DNA量一般5ng,當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠染色過(guò)深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察銀染色:銀染色液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 然后用還原劑如甲醛 使 Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色 也用于 瓊脂糖凝膠染色其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收（四）電泳1電泳裝置：電泳裝置主要有電泳儀，電泳槽及灌膠模具等2電泳方法：（1）

35、用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈放在水平桌面上，并架好梳子（2）根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般200400bp的DNA片段，可配制濃度的瓊脂糖用于電泳3配制電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化冷卻至60C（需要時(shí)可加入溴乙錠），倒入電泳槽中，待凝固4向電泳槽中倒入，其量以沒(méi)過(guò)膠面2mm為宜，小心移去梳子如樣品孔內(nèi)有 氣泡，應(yīng)設(shè)法除去5在DNA樣品中加入體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)6接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)）電壓為1-5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算

36、）7根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳一般200400bp的PCR產(chǎn)物50V電壓，電泳2040min即可（3）溴化乙錠染色后，紫外儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小.二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析其裝載的樣品量大，回收 DNA純度高長(zhǎng)度僅相差（即500bp中的1bp）的核苷酸 分 子即能分離聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N, N, N, N'四甲基乙二胺）和過(guò)硫酸銨的作用下， 丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈， 聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N , N'一亞甲 雙丙烯

37、 酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍見(jiàn)表 2.丙烯酰胺（）有效分離范圍（bp）溴酚蘭*二甲苯青*| |l002000 100 460|80500 65 26060400 45 16040200 30 7025150 15 6010 100 12 45*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對(duì)數(shù)目（bp）（一）材料1.電泳儀器：電泳儀，垂直電泳槽及其附件%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N, N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H20,加至 100ml裝于棕色瓶?jī)?nèi)，4C可保存二個(gè)月.

38、%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酰銨，1克加水至，10ml4 C可保存一周，-20 C可保存一個(gè)月.電泳緩沖液（四甲基乙烯基二胺）（二）聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠1按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂 糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出2將裝好的玻璃電泳板傾斜成 4560 C角3按表3配制所需濃度凝膠的毫升數(shù)4加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止5立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì) 6室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入緩沖液7小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn) 生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則.8將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡9接好電極，電壓為 1-8V/cm，進(jìn)行電泳10. 根據(jù)指示劑遷移位置來(lái)判定是否終止電泳11. 電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上浸入含ml的溴化乙錠溶 液中，1