微生物檢測(cè)技術(shù)

1、食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)接種工具和方法 在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。 接種和分離工具 1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)劃線接種： 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用

2、的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。劃線接種，分離純化Inoculating an agar plate to obtain single colonies灼燒灼燒微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)斜面接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 細(xì)菌的涂布分離技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù)微生物的分離、純化與接種技術(shù) 液體接種法、穿刺接種穿刺接種液體接種法：包括從斜面菌種接入培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時(shí)要求無(wú)菌操作。微生物的培養(yǎng)微

3、生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的氧氣條件n培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)設(shè)備：包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵包括接種室、恒溫培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、液體發(fā)酵搖搖床、厭氧培養(yǎng)罐等。床、厭氧培養(yǎng)罐等。n好氧培養(yǎng)：好氧培養(yǎng)：例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)例如平板培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法?；蛲鈹嚢枧囵B(yǎng)等都屬于好氧培養(yǎng)的方法。n厭氧培養(yǎng)：厭氧培養(yǎng)：除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或除了最簡(jiǎn)便的深層液體培養(yǎng)以外，可以采用物理、化學(xué)或生物學(xué)的方法來(lái)排除培養(yǎng)容器中的空氣或空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條生物學(xué)的方法來(lái)排除培養(yǎng)容器中的空氣或

4、空氣中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。在進(jìn)行厭件。對(duì)于嚴(yán)格厭氧的微生物，要用化學(xué)和物理并用的方法。在進(jìn)行厭氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用氧培養(yǎng)時(shí)，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實(shí)驗(yàn)室中常用的如葡萄糖的如葡萄糖美蘭指示劑。美蘭指示劑。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的厭氧條件n生物學(xué)方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強(qiáng)，吸收氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。此法簡(jiǎn)易，但厭氧程度低。n化學(xué)方法：利用焦性沒(méi)食子酸吸收容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒(méi)

5、食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒(méi)食子酸一邊，兩者反應(yīng)時(shí)吸收容器中的氧氣，創(chuàng)造厭氧條件。n物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培養(yǎng)物。一般為達(dá)到嚴(yán)格厭氧目的，常采用物理和化學(xué)相結(jié)合并用的方法。微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng) 微生物培養(yǎng)中的厭氧培養(yǎng)n美蘭氧化還原指示劑：0.006N NaOH 0.015% 美蘭溶液 6 葡萄糖溶液 上列三種溶液在使用時(shí)等量混合，加熱使美蘭退色，迅速放入?yún)捬豕拗小?細(xì)菌生理學(xué)檢查法 微生物保藏方法n斜面冰箱保藏法：斜面冰箱保藏法：將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長(zhǎng)出豐滿菌苔后，

6、一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長(zhǎng)出孢子，貼上標(biāo)簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個(gè)月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)室均采用。 缺點(diǎn)：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化缺點(diǎn)：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。n石蠟封藏法：石蠟封藏法：在已長(zhǎng)好的斜面菌種上加入無(wú)菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細(xì)菌和放線菌。 石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。n砂土管保藏法：砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌

7、、霉菌和產(chǎn)芽孢的細(xì)菌）。 1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過(guò)篩，出去大顆粒，加10HCl后煮沸30min，除去有機(jī)質(zhì)（也可用10HCl浸泡24h)。最后倒去酸水，用自來(lái)水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃土若干，曬干磨細(xì)，過(guò)120目篩。 2.按 土：砂1：4 的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，1601700C干熱滅菌2h。 3.在新鮮菌種斜面上加入3mL左右的無(wú)菌水，用無(wú)菌接種環(huán)制成菌懸液，用無(wú)菌吸管吸取0.20.3mL的菌懸液放入每個(gè)砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標(biāo)簽，注明菌名。 4.菌液加好后，立即進(jìn)行抽真空干燥，要求在24h內(nèi)抽干，尤其是夏天

8、要求較短時(shí)間內(nèi)抽干。搖散砂土，放干燥器內(nèi)冰箱保藏。 冷凍真空干燥保藏法：冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細(xì)菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護(hù)劑。細(xì)菌生理學(xué)檢查法 微生物生化反應(yīng)生化反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。 糖酵解試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn) V-P試驗(yàn)甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)枸椽酸鹽試驗(yàn)：尿素酶（Urease）試驗(yàn)三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)細(xì)菌生理學(xué)檢查法 糖酵解試驗(yàn)糖酵解試驗(yàn) 不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。

9、 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 淀粉水解試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 乙酰甲基甲醇（V-P）試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。細(xì)菌生理學(xué)檢查法 甲基紅（甲基紅（MR）試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基

10、紅指示劑變紅。細(xì)菌生理學(xué)檢查法 靛基質(zhì)（靛基質(zhì)（吲哚吲哚）試驗(yàn)）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。細(xì)菌生理學(xué)檢查法 檸檬酸鹽試驗(yàn)檸檬酸鹽試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能利用檸檬酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。細(xì)菌生理學(xué)檢查法 尿素酶（尿素酶（Urease）試驗(yàn)試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽(yáng)性3、尿素酶陰性細(xì)菌生理學(xué)檢查法 三糖鐵（三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)瓊

11、脂試驗(yàn)本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。 a. uninoculated b. little change/alkaline/-/- c. alkaline/acid/-/+ d. acid/acid/+/+ e. acid/acid/+/- 細(xì)菌生理學(xué)檢查法 沙門氏菌的沙門氏菌的TSI試驗(yàn)試驗(yàn)食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)一般檢驗(yàn)技術(shù) 食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的目的，是要對(duì)食品進(jìn)行細(xì)菌

12、衛(wèi)生評(píng)價(jià)。這就要求檢驗(yàn)人員在求實(shí)的精神下，科學(xué)地進(jìn)行被檢對(duì)象的采樣、樣品送檢、檢樣處理、檢驗(yàn)以及報(bào)告。在整個(gè)過(guò)程中，不得摻雜檢驗(yàn)人員的絲毫主觀臆想和工作上的馬虎，要有章可依地進(jìn)行檢驗(yàn)和報(bào)告。 樣品的采樣送檢樣品的處理檢驗(yàn)與報(bào)告 食品微生物檢樣的采集n樣品種類樣品可分大樣、中樣、小樣三種。大樣是指一整批樣品；中樣是指從樣品各部分取得的混合樣品，定型包裝及散裝食品均采樣及散裝食品均采樣250g；小樣系指分析用的樣品，又稱為檢樣，檢樣一般為25g。n采樣的方法根據(jù)樣品，如袋裝、瓶裝或罐裝食品，應(yīng)采用完整的未開封的樣品；檢樣是冷凍食品，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)（可放在冰內(nèi)、冰箱的冰盒內(nèi)或低溫冰箱保存），非冷凍食

13、品需在05中保存。（1）液體樣品的采樣：將樣品充分混勻，無(wú)菌操作開啟包裝，用100ml無(wú)菌注射器抽取，放入無(wú)菌容器。（2）半固體樣品的采樣：無(wú)菌操作開啟包裝，用滅菌勺子從幾個(gè)部位挖取樣品，放入無(wú)菌容器。（3）固體樣品的采樣：大塊整體食品應(yīng)用無(wú)菌刀具和鑷子從不同部位取樣，應(yīng)兼顧表面和深度，注意樣品代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無(wú)菌容器。樣品是固體粉末，應(yīng)邊取樣邊混合。食品微生物檢樣的采集（4）冷凍食品的采樣：大包裝小塊冷凍食品的采樣按小塊個(gè)體采取；大塊冷凍 食品可以用無(wú)菌刀從不同部位削取樣品或用無(wú)菌小手鋸從冷凍上鋸取樣品，也可以用無(wú)菌鉆頭鉆取碎樣品，放入無(wú)菌容器。注：固

14、體樣品或冷凍食品取樣還應(yīng)注意檢樣目的，若需檢驗(yàn)食品污染情況，可取表層樣品；若需檢驗(yàn)其品質(zhì)情況，應(yīng)再取深部樣品。（5）生產(chǎn)工序監(jiān)測(cè)采樣車間用水：自來(lái)水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水，湯料從車間容器不同部位用100ml無(wú)菌注射器抽取。車間臺(tái)面、用具及加工人員手的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)：用板孔5cm2無(wú)菌采樣板及5支無(wú)菌擦拭25cm2面積。車間空氣采樣：將5個(gè)直徑90mm的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋上平板送檢。食品微生物檢樣的采集采樣的數(shù)量采樣的標(biāo)簽：采樣前或后應(yīng)立即貼上標(biāo)簽，每件樣品必須標(biāo)記清楚，如品名、來(lái)源、數(shù)量、采樣地點(diǎn)、采樣人及采樣時(shí)間（年、月、日）取樣注意事項(xiàng)：防

15、止交叉污染或二次污染：取樣人員的個(gè)人衛(wèi)生控制 ；取樣地點(diǎn)的環(huán)境控制，空氣凈化要達(dá)到要求；取樣的器皿要求徹底消毒，避免直接與空氣接觸 ；取樣的操作要規(guī)范、迅速（無(wú)菌操作） ；減少樣品存放的時(shí)間（保持樣本原有的狀態(tài)、易變質(zhì)的樣本要冷藏）取樣要有代表性：取樣的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)；取樣的方法采樣所出的問(wèn)題 食品微生物檢驗(yàn)的樣品送檢食品微生物檢驗(yàn)的樣品送檢 采樣后，在送檢過(guò)程中，要盡可能保持檢樣原有的物理和微生物狀態(tài)，不要因送檢過(guò)程而引起微生物的減少或增多。l無(wú)菌方法采樣后，所裝樣品的容器要無(wú)菌，裝樣后盡可能密封，以防止環(huán)境中的微生物進(jìn)一步污染；l進(jìn)行微生物檢驗(yàn)的樣品，送達(dá)實(shí)驗(yàn)室要越快越好，一般不應(yīng)超過(guò)3h。若路

16、途遙遠(yuǎn)，可將不需冷凍的樣品，保持在15 環(huán)境中送檢，可采用冰桶等裝置；若需保持在冷凍狀態(tài)（如已冰凍的樣品），則需將樣品保存在泡沫塑料隔熱箱內(nèi)，箱內(nèi)可置干冰，使溫度維持在0以下，或采用其他冷藏設(shè)備；l送檢樣品不得加入任何防腐劑；l水產(chǎn)品因含水分較多，體內(nèi)酶的活力較旺盛，易于變質(zhì)。因此，采樣后應(yīng)在3h內(nèi)送檢，在送檢途中一般都應(yīng)加冰保存；l對(duì)于某些易死亡病原菌檢驗(yàn)的樣品，在運(yùn)送過(guò)程中可采用運(yùn)送培養(yǎng)基。l檢樣標(biāo)注適當(dāng)?shù)臉?biāo)記并填寫微生物學(xué)檢驗(yàn)特殊要求的送檢申請(qǐng)單。其內(nèi)容包括：樣品的描述，采樣者的姓名，采樣的日期、時(shí)間、地點(diǎn)，采樣時(shí)的溫度和濕度等食品微生物檢驗(yàn)的樣品處理食品微生物檢驗(yàn)的樣品處理不同食品的處理方法樣品處理的問(wèn)題食品微生物檢驗(yàn)