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1、轉染是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独?；化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。    理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復

2、雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。需要指出的一點，無論采用哪種轉染技術，要獲得最優(yōu)的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉染方法的操作細節(jié)，都需要考慮。細胞傳代(1) 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2) 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3) 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，

3、觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4) 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。(5) 用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。(6) 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7) 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8) 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9) 將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。細胞轉染1)轉染試劑的準備A. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2) 選擇合適的混合比例(1：11：2/脂質(zhì)體體積：DN

4、A質(zhì)量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。5) 將混合液在室溫放置1015分鐘。6) 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。7) 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。8) 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時。第二次細胞傳代1) 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。2) 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新粉入培養(yǎng)皿中。3) 在正常條件下培養(yǎng)24小時后

5、按照染色要求條件固定。    轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。一些傳統(tǒng)的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應用特點見下表：轉染方法原理應用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉染瞬時性轉染不適用于原代細胞操作簡便但重復性差有些細胞不適用DEAE-右旋糖苷法帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內(nèi)吞瞬時性轉染相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用轉染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜

6、電位，DNA通過膜上形成的小孔導入穩(wěn)定轉染瞬時性轉染所有細胞適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件病毒介導法通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉染可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內(nèi)細胞等逆轉錄病毒 特定宿主細胞但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期需考慮安全因素腺病毒通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉染特定宿主細胞可用于難轉染的細胞需考慮安全因素陽離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉染瞬時性轉染所有細胞適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需除血清。轉染效果隨細胞類型變化大Biolis

7、tic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達瞬時性轉染可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩(wěn)定轉染瞬時性轉染轉染細胞數(shù)有限多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞  除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細胞毒性小，轉染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性，且其合成

8、工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡在任何pH下都能充當有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進一步的改性后，其轉染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設計更復雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。       線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分

9、枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高。       GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹