遠(yuǎn)志種質(zhì)資源遺傳多樣性隨機擴增多態(tài)性DNA分析

1、遠(yuǎn)志種質(zhì)資源遺傳多樣性隨機擴增多態(tài)性DNA分析         09-08-30 08:51:00     作者：王光志萬德光    編輯：studa20【摘要】【關(guān)鍵詞】  遠(yuǎn)志；卵葉遠(yuǎn)志；遺傳多樣性；隨機擴增多態(tài)性DNAAbstract:ObjectiveTo analyze genetic diversity of Polygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. with RAP

2、D-PCR.MethodsThe RAPD-PCR reaction system was constructed with 2.5 l 10×PCR buffer, 2.0 l dNTPs, 2.0 l MgCl2, 1.0 l primer, 2 ng template and 0.3 l Taq with total reaction volume of 25 l. PCR amplifying sequences were as follows:  Initial denaturating for 4 min at 94,then denaturating for

3、15 s at 94, annealing for 1 min at 36 and extension for 1.3 min at 72. After 45 times cycle, keeping extension for 4 min. Results154 polymorphism strands were detected with 10 primers, among which 148 strands were of polymorphism. Cluster analysis indicated that all samples could be clustered into t

4、wo populations with distance coefficient of 24. ConclusionPolygala tenuifolia Willd and P. sibirica L. have rich genetic diversity. The genetic clustering has some relevance with geographical distribution of P. tenuifolia Willd and P. sibirica L.Key words:Polygala tenuifolia Willd.;  Polygala s

5、ibirica L. ;   Genetic diversity; RAPD PCR1  儀器與材料1.1 儀器HB-100型恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?；Sartorius超純水系統(tǒng)，DYY-2型恒壓電流電泳儀；DYY-型電泳槽（北京六一儀器廠）；Heraeus臺式離心機（德國）；SANYO超低溫冰箱，VIPseries -86（日本三洋）；BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠自動成像系統(tǒng)；Bio-Rad PCR儀，MyCyclerTM ThermalCycler（德國）；Therme ElectronTM 加樣器。1.2 試劑10mer隨機引物（

6、北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），-EcoT14I digest DNA Marker (TakaRa)，DNA Marker 15 000(TakaRa)，DNA Marker 2 000(TakaRa)，Taq酶(TaKaRa)2 500   U，dNTPs(TaKaRa) 2.5 mmol/L，MaCl2(TaKaRa)25 mmol/L，10×Buffer（Mg2 free）(TaKaRa)，CTAB(Amresco) ，PVP(Sigma)，-巰基乙醇(Sigma)，瓊脂糖（上海 YITO 生物儀器有限公司分發(fā)），其余為國產(chǎn)試劑。1.3 材料分別從四川、甘肅

7、、陜西、山西、河北等地采得遠(yuǎn)志P. tenuifolia Willd 及卵葉遠(yuǎn)志P.sibirica L.，采集后立即將新鮮葉片埋入變色硅膠干燥。在實驗室保存在-70超低溫冰箱內(nèi)。材料收集地點及時間見表1。憑證標(biāo)本保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室。表1  遠(yuǎn)志及卵葉遠(yuǎn)志材料來源（略）2 方法2.1 基因組DNA的提取用CTAB法提取遠(yuǎn)志基因組DNA：取約150 mg用硅膠干燥的遠(yuǎn)志葉片，置-70冰箱冷凍1 h，取出后在研缽中快速磨成粉末，迅速將粉末轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，加入700 l CTAB提取液，置65金屬浴中30 min，其間不時搖動。取出冷卻至室溫，加等體

8、積氯仿/異戊醇（241），混勻后于12 000 g/min離心10 min。取上清液，重復(fù)操作。取上清，加入2/3體積的異丙醇，于-20放置30 min，于10 000 g/min 離心10 min，去上清。用80乙醇洗沉淀2次，風(fēng)干沉淀。將沉淀溶于100 l ddH2O中，-20保存?zhèn)溆谩?     09-08-30 08:51:00     作者：王光志萬德光    編輯：studa20采用凝膠自動成像系統(tǒng)照相，檢測DNA的質(zhì)量和含量，取2 l加樣緩沖液（6×B

9、uffer）與10 l DNA樣品混合，在0.9瓊脂糖凝膠上以5 V/cm電壓條件下電泳，在紫外燈下觀察電泳凝膠。用凝膠自動成像系統(tǒng)照相，用TotalLab軟件分析凝膠圖像，定量?；蚪MDNA電泳圖譜見圖1。 2.2 RAPD擴增條件的建立分別對模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq酶用量等RAPD擴增條件進(jìn)行優(yōu)化。最終確定反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積25 l，內(nèi)含10×PCR buffer2.5 l，dNTPs 2.0 l，MgCl2 2.0l，引物1.0 l，模板2 ng，Taq酶0.3 l。擴增程序為：94預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行45循環(huán)：94變性15 s，3

10、6復(fù)性1 min，72延伸1.3 min，循環(huán)結(jié)束后72延伸4 min，-4保存。擴增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓5 V/cm，電泳緩沖液為1×TAE。反應(yīng)產(chǎn)物以DNA Marker 2000為分子量標(biāo)記，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照像、記錄。2.3 引物篩選利用建立的RAPD條件，對40條10 bp RAPD隨機引物進(jìn)行篩選，選擴增條帶清晰、多態(tài)性強的10條引物作為RAPD引物。篩選引物的堿基序列見表2。2.4 數(shù)據(jù)處理每個樣品電泳條帶按有或無記錄，電泳條帶存在時賦值為1。否則賦值為0。利用SPSS10.0 按NaiLi(1979)的方法計算材料間遺傳相似系數(shù)(GS)。計算公式

11、為：GS=2Nxy /(Nx + Ny)，其中Nxy為材料x和y共有的擴增片段數(shù)目，Nx 、Ny為材料x、y中出現(xiàn)的擴增片段總數(shù)目。根據(jù)遺傳距離，按UPGMA 法，選擇類間平均連鎖法（Between group linkage）聚類，距離測量方法用Pearson correlation 法進(jìn)行測量。3 結(jié)果3.1 多態(tài)性分析10個引物共檢測到154個位點。表2列出了10個引物對11個樣品擴增的譜帶數(shù)、多態(tài)帶及多態(tài)帶百分比。其中擴增帶數(shù)最多的引物是S499，共9條；最少的是S201、S208，共3條；平均每個引物擴增9.24條帶，其中148條帶表現(xiàn)為多態(tài)性，占總帶數(shù)的94.3，表現(xiàn)出豐富的RAP

12、D多態(tài)性。多態(tài)性結(jié)果見表2。引物S339的擴增結(jié)果見圖2。表2  遠(yuǎn)志及卵葉遠(yuǎn)志RAPD引物及多態(tài)性（略）3.2 遺傳關(guān)系聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)距離系數(shù)為24時，11個樣品明顯聚為兩類，一類為遠(yuǎn)志居群，另一類為卵葉遠(yuǎn)志居群，說明遠(yuǎn)志RAPD分子標(biāo)記的結(jié)果差異與經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類結(jié)論是一致的，均能區(qū)分遠(yuǎn)志及卵葉遠(yuǎn)志。在卵葉遠(yuǎn)志居群里，甘肅榆中和甘肅興隆山卵葉遠(yuǎn)志遺傳距離最小，為8.0，表明二者親緣關(guān)系最近，二者又和四川米易產(chǎn)者聚為一類，距四川茂縣產(chǎn)者最遠(yuǎn)，說明卵葉遠(yuǎn)志RAPD標(biāo)記上的差別與其地理分布的不同較一致；在遠(yuǎn)志居群里，陜西合陽和陜西淳化遺傳距離最小，為11.0，表明二者親緣關(guān)系最近，

13、二者又和甘肅鎮(zhèn)原聚為一類，河北邢臺產(chǎn)者與山西汾陽聚為一類，與四川茂縣產(chǎn)者距離最遠(yuǎn)。結(jié)果分析表明，在不同的地理層次上，遠(yuǎn)志和卵葉遠(yuǎn)志遺傳關(guān)系和地理分布存在著一致性，并具有豐富的遺傳多樣性特征。遠(yuǎn)志及卵葉遠(yuǎn)志的遺傳聚類圖見圖3。4 討論    在提取植物DNA時，習(xí)慣用液氮冷凍研磨。本研究將遠(yuǎn)志干燥的葉片置-70冰箱冷凍1 h后取出研磨，再用相應(yīng)的方法提取，結(jié)果與液氮冷凍的方法無差別。提示將實驗材料直接超低溫冷凍后提取DNA不失為一種簡便易行的方法。在用葉片提取DNA的同時，我們也從遠(yuǎn)志新鮮根的皮層和韌皮部成功地提取了DNA，說明該藥材的DNA較易提取。本法提取的DNA未加RNA Rase酶純化，即可滿足RAPD-PCR研究。由于遠(yuǎn)志含大量的多糖類和酚類成分，如欲進(jìn)行深入研究，則對提取后的DNA純化顯得尤為必要。    在遠(yuǎn)志P. tenuifolia Willd.居群里，四川茂縣產(chǎn)者距其他產(chǎn)地的遺傳距離最遠(yuǎn)。我們在進(jìn)行遠(yuǎn)志酸含量測定時發(fā)現(xiàn)，茂縣產(chǎn)者遠(yuǎn)志酸含量較甘肅、河北以及部分陜西產(chǎn)者高。二者是否有必然的聯(lián)系，值得深入探討。