馬流感疫苗研究進展.docx

1、Vol.35,No.7Jul.2013中國預防善醫(yī)學報ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicinedoi:10.3969/j.issn,1008-0589.2013.07.22馬流感疫苗研究進展劉春國I,劉飛2,彭永剛I,劉明L相文華卜(1.中國農(nóng)業(yè)科學院嗆爾濱獸醫(yī)研究所,獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室.黑龍江哈爾濱150001;2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸踐研究所，上海200241)中圖分類號：S852.65文獻標識碼：B文章編號：1008-0589(2013)07-0599-04收稿日期：2011-10-17基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(2010

2、03075)作者簡介：劉春國(1978-),男，湖南茶陵人，博士，助理研究員，主要從事動物流感病毒分子生物學及免疫學研究.'通信作者：E-mail：liuming04；xiangwenhual馬流感(Equineinfluenza,EI)是由正黏病密科、流感病毒屬的A型流感病毒中的馬流感病毒(Equineinfluenzavirus,EIV)引起的馬屬動物一種嚴重的上呼吸道急性高度接觸性傳染疾病，多呈暴發(fā)性流行，傳播迅速而且范圍廣泛。O1E規(guī)定馬流感為法定報告動物疫病，我國將其列為三類傳染病。1956年Sovinova等在布拉格首次分離到H7N7亞型EIV,1963年Waddell等在

3、美國分離到一株H3N8亞型EIV，隨后許多國家和地區(qū)相繼暴發(fā)EI疫悄。迄今為止H7N7亞型EI已有20多年未曾報道，一般認為該型病毒已從自然界中消失，因此目前的EI疫苗研究逐步將該亞型病毒淡出計劃外。從1987年起，H3N8亞型EIV開始分化為歐洲譜系和美洲譜系。在進化過程中美洲譜系病毒進一步進化成3個分支：即南美分支、肯塔基分支和佛羅里達分支。而歐洲譜系病毒受宿主免疫選擇壓力較小，因此遺傳變異比美洲譜系病毒相對緩慢，至今尚無進一步分化的趨勢。近年來，H3N8亞型美洲型EIV在各種壓力下正在快速變異，甚至突破種間屏障感染犬和豬【7,造成了嚴重的經(jīng)濟損失。當前疫苗接種是控制EI的有效策略時。然而

4、，當前的EI疫苗對EI的防控并不完全有效，在EI疫苗免疫的馬群中也常暴發(fā)系統(tǒng)發(fā)育分析揭示HA抗原飄移是導致疫苗免疫失敗的主要原因。除此之外，疫苗的種類、佐劑的選擇以及免疫接種方式也是影響疫苗免疫效果的重要因素。當前商品化的以及正在研制的EI疫苗有傳統(tǒng)的滅活疫苗、弱毒疫苗、亞單位疫苗、重組病毒活載體疫苗以及DNA疫苗等種類。本文對當前EI疫苗研究進行簡要的綜述，并介紹我國在EI疫苗研制方面所做的工作。1滅活疫苗目前世界上大多數(shù)國家采用EI滅活苗來防控EL一般選用具有代表意義的H7N7亞型和H3N8亞型EIV制成二價苗或多價苗，并根據(jù)病毒分子流行病學的研究，針對本國實際情況，選取流行代表病毒株制成

5、疫苗W。)。滅活疫苗安全性好，免疫原性強.不會存在毒力返強和變異的危險。EI滅活疫苗首先于20世紀60年代研制成功，接種馬后能夠提供有效的臨床保護傳統(tǒng)的滅活EI疫苗通常采用鋁膠作為佐劑，這種疫苗誘導產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間比較短，在目前的免疫程序下，二免和三免之間會存在一個免疫空白期.不能夠提供充分的保護，容易受到EIV的攻擊。輔以CpG和Emulsigen佐劑的EI疫苗(EncevacTC4,IntervetInc.)比沒有添加佐劑的疫苗顯著提高血清學反應皿。使用高分子膠佐劑的EI疫苗比鋁膠佐劑疫苗能夠誘導更高水平的和更長期的抗體反應。EquilisPrcquenzaTe疫苗選用第二代免疫剌激復合

6、物(Immune-stimulatingcomplex,ISCOM)作為佐劑，二免5個月后仍能夠提供保護.減少臨床癥狀和排毒以及發(fā)熱，并對懷孕雌馬和幼駒均安全有效網(wǎng)。ISCOM-EI疫苗(EQUIPF)肌肉接種后能夠誘導產(chǎn)生抗EIV的特異性免疫反應.并且上調(diào)IFN-7的表達，二免后攻毒，免疫馬表現(xiàn)出非常少的疾病癥狀并且沒有病毒排出"氣筆者利用反向遺傳學技術將我國優(yōu)勢流行株Aquine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA和NA基因與PR8的內(nèi)部基因進行重排.成功構建出低毒高產(chǎn)的重蛆疫苗毒rH3N8-PR,將其滅活后用法國SEPPIC公司生產(chǎn)的MONTANIDEPETGEL

7、A佐劑進行乳化，免疫后能夠誘導所有馬在短時間內(nèi)產(chǎn)生血凝抑制抗體和中和抗體，親本毒株攻毒后馬不發(fā)病，不排毒.能夠提供100%的保護網(wǎng)。EI滅活疫苗不能夠誘導有效的長期的免疫保護，需要多次免疫，而且副反應比較多，如EI疫苗接種后導致接種位點發(fā)生嚴重的纖維肉瘤照。而E1V自然感染后能夠誘導長期的免疫保護，進一步研究發(fā)現(xiàn)馬自然感染后產(chǎn)生了黏膜IgA與血清IgGa和IgGb,而傳統(tǒng)的滅活疫苗只產(chǎn)生血清IgG(T)。滅活疫苗和病毒自然感染所誘導的免疫反應的差異表明疫苗的設計還有被提升的空間。開發(fā)模擬自然感染所誘導的長期免疫保護的疫苗具有重要的意義。2弱毒活疫苗弱毒疫苗的經(jīng)典制備方法是連續(xù)傳代致弱，即將病毒

8、在含有正常馬血清的雞胚尿囊腔中連續(xù)繼代致弱。弱毒疫苗鼻內(nèi)接種馬，能夠誘導良好的免疫保護。Youngner等通過逐步降低溫度的方式將EIV在雞胚中進行連續(xù)傳代，篩選到一株穩(wěn)定的冷適應溫敏感突變疫苗株，鼻內(nèi)接種不會引起不良反應和明顯的臨床癥狀，僅在呼吸道上部夏制.并能夠誘導強烈的血清IgGa和IgGb抗體反應，一個劑量免疫后就能夠提供三個月的臨床保護，該疫苗已經(jīng)在北美上市四。Chambers等構建了具有安全、穩(wěn)定和低傳播特性的冷適應活疫苗FluAvertI.N.,實驗證明該疫苗，一免6個月后攻毒，可以減少臨床癥狀的嚴重程度和持續(xù)期，能夠對EI野毒株的攻擊提供有效保護叫Quinlivan和Breat

9、hnach等利用反向遺傳學技術構建了NS1蛋白C末端截短的EIV突變株，該突變株在體外削弱了抑制IFN產(chǎn)生的能力，并且與親本株相比，突變株在雞胚、MDCK細胞或鼠模型中不能夠有效復制。因此，致弱的NS1突變株有潛力作為EI活疫苗候選株【心七弱毒疫苗免疫后誘導典型的黏膜IgA與血清IgGa和IgGb抗體反應，能夠模擬自然感染誘導產(chǎn)生體液、黏膜和細胞免疫反應，發(fā)揮良好的免疫保護效果，然而弱毒疫苗的安全性問題一直是其難以突破的瓶頸，而重組病毒活載體疫苗則不失為一個好的選擇。3重組活載體疫苗重組痘病毒載體可以在宿主細胞中表達外源蛋白，并將其以與自然感染相似的途徑提呈給免疫系統(tǒng)，因此廣泛用于多種疫苗的研

10、制。以修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)作為栽體制備的EI疫苗能夠刺激EIV特異性抗體的產(chǎn)生，并上調(diào)IFNr的表達，攻毒后能夠提供良好的保護效果，不出現(xiàn)臨床癥狀，不排毒叫。2003年，EI金絲雀痘病毒活載體疫苗(Proteq-Flul,Merial)在歐盟得到許可用于馬的免疫，單次免疫就能夠刺激產(chǎn)生體液免疫反應，并且攻毒后能夠保護馬不產(chǎn)生臨床癥狀，不排毒。Paillot也構建了包含上述兩種抗原的重組金絲雀活載體疫苗，通過了美國農(nóng)業(yè)部的認證。Sobol等用ALVAC重組活載體疫苗(金絲雀痘病毒載體表達上述兩種病毒的HA蛋白)免疫馬，能夠誘導抗體產(chǎn)生較早，并能夠持續(xù)6個月對同型EIV產(chǎn)生免疫保護

11、皿。Minke等構建了重組金絲雀痘病毒載體EI疫苗(rCP-EIV疫苗)，二免5個月后仍能夠提供保護，表明該疫苗避免了傳統(tǒng)滅活疫苗二免和三免之間的免疫空白期凹。1型馬皰疹病毒和EIV都是馬呼吸道疾病的重要病原，將兩者聯(lián)合起來制成疫苗將有良好的應用前景。將EIVHA基因插入到1型馬皰疹病毒中，免疫后能夠誘導長期持久的抗EIV和1型馬皰疹病毒的抗體反應網(wǎng)。筆者以人5型復制缺陷型腺病毒為載體成功構建了重組EIVHA基因的重組腺病毒。小鼠模型實驗結果表明，該疫苗能夠對親本病毒的攻擊提供完全保護，并有效清除病毒在小鼠體內(nèi)的復制。馬體實驗果表明該疫苗以10sTCID«的劑量一次免疫即能夠誘導所有

12、馬產(chǎn)生中和抗體(叫4亞單位疫苗目前EI亞單位疫苗的研究相對較少，Olsen等通過桿狀病毒表達EIVHA蛋白，鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠能夠誘導產(chǎn)生病毒特異性抗體，但不具有中和活性，僅能夠對病毒攻擊提供部分保護。筆者利用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功雙表達了EIVHA和Ml蛋白，并成功裝配成病毒樣顆粒.將其以不同劑量免疫BALB/c小鼠，不僅能蝶誘導病毒特異性血凝抑制抗體產(chǎn)生，而且還能夠誘導產(chǎn)生中和抗體，能夠對親本病毒的攻擊提供100%的保護四。鑒于亞單位疫苗在人和動物多種疾病的研究中已經(jīng)取得成功，因此我們有信心成功研制EI亞單位疫苗。5DNA疫苗DNA疫苗是第三代疫苗，因其能夠誘導與自然感染相似的免疫反應

13、，所以可以替換傳統(tǒng)疫苗。小鼠、雪貂、雞及靈長類動物等的免疫實驗已經(jīng)證明DNA疫苗對于抵抗流感病毒感染是有效的。Olsen等將編碼EIVHA蛋白的質(zhì)粒DNA免疫BALB/c小鼠不僅能夠誘導病毒特異性ELISA抗體，還能夠誘導產(chǎn)生中和抗體。首免后3周進行加強免疫，與對照鼠相比免疫組能夠更快速的清除感染，但不能夠產(chǎn)生保護；而首免9周后加強免疫，可產(chǎn)生90%的完全保護兇2%Lunn和Soboil等將含有EIVHA基因的DNA疫苗免疫馬，黏膜免疫能夠提供完全保護，不產(chǎn)生臨床癥狀，而皮膚接種只能提供部分保護（加七6我國馬流感疫苗的研究概況70年代，我國曾研制過3種EI滅活疫苗：H7N7亞型單價苗（疫苗株為

14、京防-74株）、H3N8亞型單苗（疫苗株為美國邁阿密63株）和EI聯(lián)苗，但這些疫苗都沒有大面積應用，而且早已不用，一旦EI發(fā)生后，主要采取一些對癥治療措施。目前我國尚沒有具有自主知識產(chǎn)權的商品化EI疫苗，所用疫苗都依賴于國外引進，主要是法國Merial公司生產(chǎn)的重組金絲雀活載體疫苗Proteq-FluU在2008年北京奧運馬術比賽舉辦之際，為了預防EI.我國不得不從國外引進EI疫苗進行緊急預防接種。然而國外進口疫苗價格不但昂貴，而且不能夠對我國EIV流行株的攻擊提供有效的臨床保護四?；谏鲜龃嬖诘膯栴}.哈爾濱獸醫(yī)研究所馬病專家相文華研究員領導的馬病課題組對我國EI的血清學、病原學和分子生物學開

15、展了普查與監(jiān)測，在了解了EI在我國的流行分布情況以及我國EIV抗原和遺傳變異規(guī)律的基礎上，篩選出我國具有代表性EIV疫苗參考株.利用傳統(tǒng)的經(jīng)典方法制備了滅活疫苗.試驗表明該疫苗能夠誘導良好的免疫保護。同時劉春國等開展了利用反向遺傳學技術構建適應雞胚和細胞的高產(chǎn)疫苗株，動物試驗結果表明該疫苗能夠對病毒攻擊提供完全保護網(wǎng)?？紤]到滅活疫苗的缺點和重蛆活載體疫苗的優(yōu)勢，該課題組在研究滅活疫苗的同時也進行了重組活載體疫苗的研究.如重組旗痘病毒活載體疫苗、重蛆腺病毒活載體疫苗四和甲病毒復制子疫苗，另外也開展了DNA疫苗、冷適應活疫苗和亞郎位疫苗的研究。相關研究已取得了階段性研究成果，并申請了專利。這些工作

16、為研制符合我國國情的擁有我國自主知識產(chǎn)權的EI疫苗奠定了基礎，為我國EI的防控提供理論基礎和技術儲備，同時也填補了我國E【疫苗研究的空白。7結語馬術比賽的蓬勃興起凸顯了馬作為娛樂動物的重要性。近年來馬術比賽在我國也正逐漸興起，多項國際馬術賽事在我國舉行，不可避免馬匹在國際以及國內(nèi)間的流動，由于國外EI疫情的不斷暴發(fā)，增加了我國E1疫情發(fā)生的風險。而且我國馬匹基本不進行疫苗免疫，更增加了我國EI發(fā)生的隱患。另外，由于EIV的抗原漂移或轉變，原有疫苗往往不能提供良好的保護，這也是E1防制過程中需要克服的主要矛盾。包括0IE和WHO在內(nèi)的EI專家調(diào)查委員會每年都會對EI暴發(fā)的信息以及分離株的特性做以

17、詳細的記錄和分析，并推薦更合適的疫苗株。然而不同國家的流行病學監(jiān)測水平以及病毒搜集的差異導致關于優(yōu)勢流行病毒的信息有所差異。這就有必要進行全球性的流行病學監(jiān)測以及增加人們對疫苗更新所帶來的利益達到充分的認識。就我國目前的狀況而言也迫切需要建立完善的EI監(jiān)測體系，相關部門緊密通力協(xié)作，及時篩選更新符合我國國情的EI疫苗株，并利用先進的技術開展多種不同類型疫苗的研究，為我國的EI防控保駕護航。參考文獻：1 WaddellGH,TeiglandMB,SigelMM.AnewinfluenzavirusassociatedwithequinerespiratorydiseaseJ.JAmVetMedA

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