微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的簡單染色和革蘭氏染色

1、.一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康? 1、學(xué)習(xí)并掌握簡單染色和革蘭氏染色的原、學(xué)習(xí)并掌握簡單染色和革蘭氏染色的原理及步驟。理及步驟。 2 2、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色技術(shù)和無菌操作。、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色技術(shù)和無菌操作。3 3、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。實(shí)驗(yàn)二 .二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理1、細(xì)菌的簡單染色原理、細(xì)菌的簡單染色原理細(xì)菌菌體微小而透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須通過染色來增細(xì)菌菌體微小而透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須通過染色來增加菌體的顯示力，從而更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。加菌體的顯示力，從而更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在堿性、中性或弱酸性溶液中，細(xì)

2、菌菌體通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電在堿性、中性或弱酸性溶液中，細(xì)菌菌體通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料的染色部分帶負(fù)電荷），因此，離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料的染色部分帶負(fù)電荷），因此，堿性染料很容易與菌體結(jié)合而是菌體著色。堿性染料很容易與菌體結(jié)合而是菌體著色。2、細(xì)菌革蘭氏染色的原理、細(xì)菌革蘭氏染色的原理G+菌和菌和G-菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成有較大的區(qū)別菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成有較大的區(qū)別。G+菌菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透

3、性降低，結(jié)晶紫聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被滯留在細(xì)胞內(nèi)，因此細(xì)菌仍碘復(fù)合物被滯留在細(xì)胞內(nèi)，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，經(jīng)番紅復(fù)染后呈藍(lán)紫色。保留初染時(shí)的顏色，經(jīng)番紅復(fù)染后呈藍(lán)紫色。G-菌菌細(xì)胞壁的細(xì)胞壁的外膜層外膜層富含類脂富含類脂，而且其而且其肽聚糖肽聚糖層次薄、交聯(lián)度低；乙醇脫色時(shí)，層次薄、交聯(lián)度低；乙醇脫色時(shí)，細(xì)胞壁因類脂被溶解而出現(xiàn)較大縫隙，使得細(xì)胞壁因類脂被溶解而出現(xiàn)較大縫隙，使得菌體內(nèi)的結(jié)晶紫菌體內(nèi)的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物較易碘復(fù)合物較易滲出滲出，而使菌體變成無色而使菌體變成無色，再經(jīng)番紅再經(jīng)番紅復(fù)染復(fù)染就就成為紅色。成為紅色。.三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材1 1、菌種：

4、、菌種：革蘭氏染色：培養(yǎng)12 h16 h的枯草芽孢桿菌120和培養(yǎng)24 h的大腸桿菌。2 2、染色液和試劑：、染色液和試劑：結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、沙黃或蕃紅3 3、器材：、器材：載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。菌齡對革蘭氏染色結(jié)果的影響：選取處于活躍生菌齡對革蘭氏染色結(jié)果的影響：選取處于活躍生長期長期指數(shù)生長期的菌體進(jìn)行革蘭氏染色。菌指數(shù)生長期的菌體進(jìn)行革蘭氏染色。菌體尚未成熟或菌體過老，可能使染色結(jié)果呈現(xiàn)相體尚未成熟或菌體過老，可能使染色結(jié)果呈現(xiàn)相反的結(jié)果。反的結(jié)果。.（一）簡單染色的步驟（一）簡單染色的步驟 （見見P11P11）1 1、涂片涂片：取干凈載玻片，火焰灼燒后

5、，橫放于玻片架上；取干凈載玻片，火焰灼燒后，橫放于玻片架上； 在在載玻片中央滴載玻片中央滴一小滴一小滴生理鹽水，生理鹽水， 用接種環(huán)以無菌操作取少許用接種環(huán)以無菌操作取少許菌體菌體于水滴中于水滴中（注：不要挑破培養(yǎng)基注：不要挑破培養(yǎng)基）， 混勻并涂成薄膜混勻并涂成薄膜（注：涂片不易過厚注：涂片不易過厚）。2 2、干燥干燥：用夾子夾住載玻片一端（：用夾子夾住載玻片一端（菌膜面菌膜面朝上朝上），反復(fù)反復(fù)通過通過火焰火焰高處高處數(shù)次，數(shù)次， 烘干菌液（烘干菌液（注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形）。）。3 3、固定固定：用夾子夾住載玻片一端，迅速通過火焰用夾

6、子夾住載玻片一端，迅速通過火焰2 23 3次，次， 使菌體固定于載玻片上。使菌體固定于載玻片上。4 4、染色染色：將玻片平放于玻片架上，加適量（：將玻片平放于玻片架上，加適量（以蓋滿菌膜為度以蓋滿菌膜為度）染液于涂片上。）染液于涂片上。 染色時(shí)間染色時(shí)間1-2min1-2min。5 5、水洗水洗：倒去染液，用洗瓶自載玻片的一端輕輕沖洗：倒去染液，用洗瓶自載玻片的一端輕輕沖洗（切勿將菌膜沖掉）（切勿將菌膜沖掉）， 直至流下的水為無色為止。直至流下的水為無色為止。6 6、干燥干燥：將玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水紙沿菌膜外緣吸干殘留水分。：將玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水紙沿菌膜外緣吸干殘

7、留水分。7 7、鏡檢鏡檢：先用低倍鏡找到視野后，再換油鏡觀察：先用低倍鏡找到視野后，再換油鏡觀察 。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟.（二）革蘭氏染色（二）革蘭氏染色 （見見P12P12) )1、涂片、固定、涂片、固定（1）涂片涂片“三區(qū)三區(qū)”涂片法。涂片法。在載玻片的左端先加一滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量蘇云金芽孢桿菌與左邊水滴混合；將載玻片傾斜使少量菌液延伸至玻片中央。在載玻片的右端加一滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量大腸桿菌與右邊水滴混合；將玻片傾斜使少量菌液延伸至玻片中央。（三區(qū)：左區(qū)蘇云金芽孢桿菌區(qū)；中央?yún)^(qū)兩種菌的混合區(qū)；右區(qū)大腸桿菌區(qū)）。（2）干燥及固定。干燥及固定。步驟同簡單染色法。涂片

8、不易過厚，否則造成局部菌體脫色不完全，而使G-菌呈現(xiàn)革蘭氏陽性結(jié)果。2、染色、染色（1）初染。）初染。將玻片置于玻片架上，加適量（以覆蓋菌膜為度）結(jié)晶紫染液染色12 min；傾去染液，用洗瓶自載玻片的一端輕輕沖洗，直至流下的水為無色。（2）媒染。）媒染。加盧戈氏碘液一滴，染色1 min，水洗。（3）脫色。）脫色。將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無色，立即水洗。（4）復(fù)染。）復(fù)染。滴加蕃紅復(fù)染2min后，立即水洗至流出液無色。（5）干燥及鏡檢。）干燥及鏡檢。將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。先用低倍鏡找到視野后，再換油鏡觀察 ，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。脫色時(shí)間對

9、革蘭氏染色結(jié)果的影響：脫色時(shí)間過短，脫色時(shí)間對革蘭氏染色結(jié)果的影響：脫色時(shí)間過短，G-菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陽性結(jié)果；菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陽性結(jié)果；如果脫色時(shí)間過長，如果脫色時(shí)間過長，G+菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陰性結(jié)果。菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陰性結(jié)果。媒染時(shí)間對革蘭氏染色結(jié)果的影響：媒染時(shí)間過短，不利于結(jié)晶紫與細(xì)胞之間媒染時(shí)間對革蘭氏染色結(jié)果的影響：媒染時(shí)間過短，不利于結(jié)晶紫與細(xì)胞之間的結(jié)合，而使的結(jié)合，而使G+菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陰性結(jié)果菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陰性結(jié)果;媒染時(shí)間過長，而使媒染時(shí)間過長，而使G-菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏菌轉(zhuǎn)呈革蘭氏陽性結(jié)果。陽性結(jié)果。.結(jié)晶紫結(jié)晶紫碘碘 液液95%乙醇乙醇番番 紅紅初初 染染12min媒媒 染染1min脫色脫色2025s復(fù)復(fù) 染染2min.繪出大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。（五）作業(yè)（五）作業(yè) 大腸桿菌（10100） 枯草芽孢桿菌120（10100）大腸桿菌大腸桿菌_ 色，革蘭氏色，革蘭氏_性菌；性菌；枯草芽孢枯草芽孢桿菌桿菌120_ 色，革蘭氏色，革蘭氏_性菌性菌。（六）思考與討論（六）思考與討論1 1、造成革蘭氏染色結(jié)果不正確（假陽性或假陰性）的主要原因有哪些？、造成革蘭氏染色結(jié)果不正確（假陽性或假陰性）的主要原因有哪些？2 2、如果某一細(xì)菌的革蘭氏染色