第五章體內藥物分析

1、第五章第五章 體內藥物分析體內藥物分析 體內藥物分析是一門研究生物機體中藥體內藥物分析是一門研究生物機體中藥物及其代謝物和內源性物質的質與量變化規(guī)律物及其代謝物和內源性物質的質與量變化規(guī)律的分析方法學的分析方法學 體內藥物分析又被稱為體內藥物分析又被稱為 生物醫(yī)藥分析生物醫(yī)藥分析 Biomedical AnalysisBiomedical Analysis 生物藥物分析生物藥物分析 Biopharmaceutical AnalysisBiopharmaceutical Analysis藥物分析的重要藥物分析的重要分支學科分支學科研究生物機體中外源性藥物及其代謝物和內源性研究生物機體中外源性藥物

2、及其代謝物和內源性活性物質的質與量的變化規(guī)律活性物質的質與量的變化規(guī)律藥物的體內研究和治療藥物監(jiān)測藥物的體內研究和治療藥物監(jiān)測綜合性較強的應用學科綜合性較強的應用學科:分析方法學分析方法學為將來的相關課程（臨床藥學、臨床藥理學、生為將來的相關課程（臨床藥學、臨床藥理學、生物藥劑學）學習和實驗研究奠定重要的基礎物藥劑學）學習和實驗研究奠定重要的基礎藥物進入體內后藥物進入體內后經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄等動力學過程經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄等動力學過程化學結構和存在狀態(tài)都可能發(fā)生變化化學結構和存在狀態(tài)都可能發(fā)生變化在不同個體中存在差異（個體差異）在不同個體中存在差異（個體差異）進而直接影響到藥物在

3、不同個體中的治療效應進而直接影響到藥物在不同個體中的治療效應和毒副作用和毒副作用需對生物體內藥物及其代謝物進行研究分析需對生物體內藥物及其代謝物進行研究分析藥物在人（或動物）體內的存在形式藥物在人（或動物）體內的存在形式 游離型游離型: :原形藥物或代謝物原形藥物或代謝物 藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等結合藥物或其代謝物與葡萄糖醛酸等結合: :綴合物綴合物 藥物與蛋白質結合藥物與蛋白質結合: :結合物結合物體內藥物分析的任務體內藥物分析的任務 檢測人（或動物）的體液或組織（生物樣本）檢測人（或動物）的體液或組織（生物樣本）中的藥物或特定代謝物的濃度中的藥物或特定代謝物的濃度 生物樣本的特點生物樣

4、本的特點 1.1.藥物濃度：藥物濃度：低，要求方法靈敏度高低，要求方法靈敏度高 2.2.干擾物質：干擾物質：多，要求方法專屬性好多，要求方法專屬性好 3.3.樣品量少、不能重復取樣樣品量少、不能重復取樣. .生物樣品多數(shù)在特生物樣品多數(shù)在特定條件下采集，無法再次取樣，且濃度低、變化幅定條件下采集，無法再次取樣，且濃度低、變化幅度大度大. . 在樣品測定之前，在樣品測定之前，進行適當?shù)臉悠分苽?，進行適當?shù)臉悠分苽?，進行分離、純化、濃集、必要時還需對待測組分進進行分離、純化、濃集、必要時還需對待測組分進行化學衍生化，然后進行測定行化學衍生化，然后進行測定 評價藥物的安全性（臨床前研究）：動物評價藥

5、物的安全性（臨床前研究）：動物 評價藥物的有效性（臨床研究）：人體（健康評價藥物的有效性（臨床研究）：人體（健康志愿者或患者）志愿者或患者） 用藥的安全、有效與合理：人體（患者用藥的安全、有效與合理：人體（患者TDM :TDM :治療藥物血濃度監(jiān)測治療藥物血濃度監(jiān)測 ） 分析方法有分析方法有: : 色譜法色譜法:HPLC,HPCE,GC:HPLC,HPCE,GC 光譜法光譜法: :比色法、紫外比色法、紫外- -可見分光光度法、熒可見分光光度法、熒光分光光度法、原子吸收分光光度法光分光光度法、原子吸收分光光度法 免疫分析法免疫分析法: :放射免疫法放射免疫法RIARIA、酶免疫法、酶免疫法EIA

6、EIA、化學發(fā)光酶免疫、熒光免疫分析化學發(fā)光酶免疫、熒光免疫分析 聯(lián)用技術聯(lián)用技術:GC-MS:GC-MS、LC-MSLC-MS、LC-NMRLC-NMR 發(fā)展概況發(fā)展概況 2020世紀世紀6060年代年代: :臨床藥理學與生物藥劑學建立臨床藥理學與生物藥劑學建立 7070年代初年代初: :體內藥物分析在國外開始建立體內藥物分析在國外開始建立 7070年代末年代末: :血藥濃度監(jiān)測廣泛用于臨床血藥濃度監(jiān)測廣泛用于臨床 8080年代年代: :體內藥物分析學科雛形基本形成體內藥物分析學科雛形基本形成 國內發(fā)展概況：在國內發(fā)展概況：在7070年代末受到關注年代末受到關注19791979年有相關論文發(fā)

7、表年有相關論文發(fā)表 19811981年在年在“中國藥學會藥物分析第一次學術會中國藥學會藥物分析第一次學術會議議”大會上作學術報告，引起了廣泛的關注和興趣大會上作學術報告，引起了廣泛的關注和興趣8080年代中期，許多高等醫(yī)藥院校為本科生、碩士研年代中期，許多高等醫(yī)藥院校為本科生、碩士研究生開設了體內藥物分析必修和選修課程究生開設了體內藥物分析必修和選修課程. . 學科主要研究問題學科主要研究問題 游離型血藥濃度測定方法研究游離型血藥濃度測定方法研究 血中游離型藥物濃度血中游離型藥物濃度(F)(F)與總濃度與總濃度(T)(T)的比率的比率(F/T)(F/T)及唾液與血液游離濃度的比率及唾液與血液游

8、離濃度的比率(S/P)(S/P)以及它們以及它們之間的相關性的研究之間的相關性的研究 代謝物的監(jiān)測與研究代謝物的監(jiān)測與研究 對映體的監(jiān)測與研究對映體的監(jiān)測與研究 體內微量元素的測定與研究體內微量元素的測定與研究 方便、快捷的樣品制備方法與樣品直接進樣分方便、快捷的樣品制備方法與樣品直接進樣分析的研究析的研究 分析新方法、新技術的聯(lián)用研究分析新方法、新技術的聯(lián)用研究 體內藥物分析方法的質量控制研究體內藥物分析方法的質量控制研究第一節(jié)第一節(jié) 常用體內樣品的制備與貯藏常用體內樣品的制備與貯藏一一. 樣品種類，采集與制備樣品種類，采集與制備v 1.1.血樣：血藥濃度一般指血漿（血清中）藥血樣：血藥濃度

9、一般指血漿（血清中）藥物濃度，它可正確反映藥物在作用點的濃度。物濃度，它可正確反映藥物在作用點的濃度。v 藥物在血中分布均勻后取樣：藥物在血中分布均勻后取樣：a.a.動物：動脈動物：動脈或心臟，或心臟，b.b.人靜脈或毛細管采血人靜脈或毛細管采血. . 血液：血液：a.a.加抗加抗凝劑混合（凝劑混合（EDTA,EDTA,肝素肝素etc),etc),離心離心(3000r/min (3000r/min ，5min)5min)取上清液為取上清液為血漿血漿。b.b.室溫放室溫放0.51h0.51h，3000 3000 r/minr/min離心離心510 min ,510 min ,取上清液為取上清液為

10、血清血清。C.C.全血全血. . 要點：取樣后及時分離出血漿（清），要點：取樣后及時分離出血漿（清），隨后進行分析，若不能馬上測定，應密塞后隨后進行分析，若不能馬上測定，應密塞后置冰箱保存（時間短：置冰箱保存（時間短：44，長：，長：-20-20) ) 應用應用: :藥物動力學藥物動力學; ;生物利用度生物利用度; ;臨床治臨床治療藥物監(jiān)測療藥物監(jiān)測(TDM)(TDM)v 2 2尿液尿液 優(yōu)點：易收集、量大，主要用于藥物劑量回優(yōu)點：易收集、量大，主要用于藥物劑量回收，尿清除率，生物利用度研究，以及藥物代謝收，尿清除率，生物利用度研究，以及藥物代謝研究，一般采集研究，一般采集24h24h尿液，最

11、好立即測定，否則尿液，最好立即測定，否則要加防腐劑（要加防腐劑（PhCHPhCH3 3,CHCl,CHCl3 3etcetc）置冰箱保存。）置冰箱保存。 缺點：尿液中藥濃度與血藥濃度相關性差，缺點：尿液中藥濃度與血藥濃度相關性差，腎功能不全者不適于取樣腎功能不全者不適于取樣v 33唾液：唾液： 優(yōu)點：樣品易得，采集無痛，無危險。優(yōu)點：樣品易得，采集無痛，無危險。 缺點：一般唾液中藥濃與血藥濃度不吻合，缺點：一般唾液中藥濃與血藥濃度不吻合，易變易變v 4.4.組織：用于藥物體內動力學研究組織：用于藥物體內動力學研究v 步驟：取樣，勻漿，去蛋白步驟：取樣，勻漿，去蛋白v 5.5.頭發(fā)：主要用于體內

12、微量元素的測定。頭發(fā)：主要用于體內微量元素的測定。v 枕部取樣，洗凈，消化或者高溫灰化后測定枕部取樣，洗凈，消化或者高溫灰化后測定v 二二 體內樣品的貯藏與處理體內樣品的貯藏與處理v 1.1.冷藏或冷凍冷藏或冷凍v 2.2.去活性：快速冷凍；微波照射；加入酶活性去活性：快速冷凍；微波照射；加入酶活性阻斷劑或者抗氧劑；高溫煮沸。阻斷劑或者抗氧劑；高溫煮沸。第二節(jié)第二節(jié).體內樣品分析的前處理體內樣品分析的前處理v依據(jù)依據(jù): 1 1）樣品種類（血，尿）樣品種類（血，尿） 2 2）被測藥物結構及性質）被測藥物結構及性質 3 3）測定方法：專屬性，）測定方法：專屬性，LODLOD 應用：應用： 1.1.

13、藥物含量高，處理簡單。藥物含量高，處理簡單。 2.2.樣品干擾小樣品干擾小,(,(如尿）如尿）, ,前處理簡單前處理簡單 3.3.測定方法專屬性好測定方法專屬性好(HPLC),(HPLC),前處理簡單。前處理簡單。 v 一一. . 目的目的v 1.1.使待測藥物游離使待測藥物游離v 2.2.滿足測定方法的要求滿足測定方法的要求: :重點考慮分析方法的重點考慮分析方法的靈敏度和專屬性靈敏度和專屬性. .v 3. 3.改善分析環(huán)境改善分析環(huán)境: :如如HPLC.HPLC.二二. .樣品前處理方法樣品前處理方法1.1.去除蛋白質去除蛋白質v 目的：目的：使結合型藥物釋放出來使結合型藥物釋放出來 減少

14、乳化減少乳化 保護色譜柱保護色譜柱 方法：方法： 1 1）加入與水相混溶的有機溶劑加入與水相混溶的有機溶劑（EtOH,MeEtOH,Me2 2CO, CO, CHCH3 3CN, etcCN, etc）, ,混勻后離心，取上清液分析（破壞混勻后離心，取上清液分析（破壞氫鍵使蛋白質凝聚氫鍵使蛋白質凝聚）. . 2 2）加中性鹽加中性鹽NaNa2 2SOSO4 4,(NH,(NH4 4) )2 2SOSO4 4 ：與水結合，：與水結合，使蛋白質脫水而沉淀，離心后取上清液。使蛋白質脫水而沉淀，離心后取上清液。 3 3）加強酸（）加強酸（CClCCl3 3COOH,HClOCOOH,HClO4 4）,

15、 ,適于適于pHpHPI,PI,蛋蛋白質白質為陽離子為陽離子,與強酸形成不溶性鹽而沉淀。與強酸形成不溶性鹽而沉淀。 4 4）加鋅或銅鹽的沉淀劑如）加鋅或銅鹽的沉淀劑如CuSOCuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4, ZnSO, ZnSO4 4 NaOHNaOH, ,適于適于pHpHPI,PI,蛋白質為陰離子，與金屬陽離蛋白質為陰離子，與金屬陽離子形成不溶鹽而沉淀子形成不溶鹽而沉淀 5 5）酶解法：用枯草菌溶素使肽鏈降解，）酶解法：用枯草菌溶素使肽鏈降解，5060 5060 具最大活力，條件溫和，作用強，適于酸不穩(wěn)定具最大活力，條件溫和，作用強，適于酸不穩(wěn)定及結合牢固的藥物及結合牢固的藥

16、物. . 6) 6)熱凝固法熱凝固法 樣品前處理樣品前處理 2. 2.分離，純化，濃集分離，純化，濃集 目的：消除干擾，使待測物以適合的形式和目的：消除干擾，使待測物以適合的形式和量用于分析。量用于分析。 (1)(1)液液- -液提?。ㄒ禾崛。↙LELLE） 藥物親脂性強藥物親脂性強 內源性雜質親水性強內源性雜質親水性強 采用有機溶劑提取后可大大純化樣品采用有機溶劑提取后可大大純化樣品 1 1）有機溶劑）有機溶劑( (極性見表極性見表5-1)5-1)：要求對待側組分：要求對待側組分S S大，大，bpbp低，水溶性小，無毒，穩(wěn)定，不易乳化。低，水溶性小，無毒，穩(wěn)定，不易乳化。常用常用EtEt2

17、2O,CHClO,CHCl3 3 2 2）二相體積比：采用少量多次提取法。）二相體積比：采用少量多次提取法。 3 3）水相）水相pHpH值：主要考慮藥物的酸堿性值：主要考慮藥物的酸堿性 如：選擇水相如：選擇水相pHpH為堿性為堿性藥物是生物堿藥物是生物堿內源性雜質為酸性內源性雜質為酸性游離堿游離堿 脂液脂液成鹽成鹽 水溶性增加水溶性增加（2) 2) 固相萃?。ü滔噍腿。⊿olid-phase Extraction,SPESolid-phase Extraction,SPE） 小型柱色譜，填料粒度小，分離效能高，小型柱色譜，填料粒度小，分離效能高，無乳化現(xiàn)象，處理樣品速度快，常用提取：無乳化現(xiàn)象

18、，處理樣品速度快，常用提?。?a.a.親水性用硅藻土；親水性用硅藻土；b.b.疏水性用疏水性用C C1818. .由由VarianVarian公司生產(chǎn)的半自動樣品制備系統(tǒng)（公司生產(chǎn)的半自動樣品制備系統(tǒng)（Advanced Advanced automated sample processor, AASP)automated sample processor, AASP)使使SPESPE更更簡便，快速，樣品經(jīng)簡便，快速，樣品經(jīng)1010個固定微型柱離線萃取，個固定微型柱離線萃取，微柱轉移到自動進樣器做預柱，由流動相將分微柱轉移到自動進樣器做預柱，由流動相將分析物洗脫至分析柱。析物洗脫至分析柱。 缺點

19、：成本高缺點：成本高v (3)(3)超濾超濾: :一種膜分離技術一種膜分離技術, ,按照分子量大按照分子量大小小, ,分離水溶性生物大分子分離水溶性生物大分子. .3.3.綴合物水解綴合物水解 含極性基團（含極性基團（OH,NHOH,NH2 2,COOH,COOH）的藥物，常與）的藥物，常與內源性物質（如葡萄糖醛酸）形成綴合物，當內源性物質（如葡萄糖醛酸）形成綴合物，當測定尿液中藥物濃度時，需將綴合物中藥物釋測定尿液中藥物濃度時，需將綴合物中藥物釋出，常用酸解或酶解的方法。出，常用酸解或酶解的方法。4.4.化學衍生化學衍生目的：目的：1 1）提高檢測靈敏度，如）提高檢測靈敏度，如HPLCHPL

20、C紫外檢測紫外檢測2 2）增加藥物穩(wěn)定性。）增加藥物穩(wěn)定性。3 3）提高藥物分析能力，如：）提高藥物分析能力，如： a.GCa.GC中的中的-COOH-COOH衍生成衍生成-COOCH-COOCH3 3增大揮發(fā)增大揮發(fā) 性，減少極性。性，減少極性。 b.b.手性分離中：生成非光學異構體（普通手性分離中：生成非光學異構體（普通柱色譜分析）柱色譜分析）1 1）GC: RCOOHGC: RCOOH Ar Ar-OH-OHCHCH2 2N N2 2 CHCH3 3OHOHRCOOCHRCOOCH3 3RCOOSiMeRCOOSiMe3 3ArOCOCHArOCOCH3 3Ar-O-CHAr-O-CH3

21、 3 Ar-OSiMe3Ar-OSiMe3 2 2）手性分離：）手性分離： + +（R R）-E-E R-SA R-SA S-SA S-SA手性藥物手性藥物 （R R）E-E-（R R）SASA（R R）E-E-（S S）SASA光活性試劑光活性試劑非對映異構體非對映異構體 3 3）HPLC:HPLC:如慶大霉素如慶大霉素C C組分檢查組分檢查 a.a.柱前柱前衍生衍生 b.b.柱后柱后衍生衍生，需一個額外的泵，需一個額外的泵 第三節(jié)第三節(jié) 定量分析方法驗證定量分析方法驗證v 一一 分析方法的建立分析方法的建立v 1.1.分析方法分析方法: :色譜分析法色譜分析法; ;免疫分析法免疫分析法;

22、;生物學生物學方法方法. .v 2. 2.步驟步驟:(1):(1)色譜條件選擇色譜條件選擇,(2),(2)色譜條件優(yōu)化色譜條件優(yōu)化: :空白溶劑試驗空白溶劑試驗考查溶劑影響考查溶劑影響; ;空白生物基質試驗空白生物基質試驗考查生物基質中內源性物質的影響考查生物基質中內源性物質的影響( (方法特異性方法特異性); ); 質控生物樣品試驗質控生物樣品試驗（空白生物基質中加入待測藥物）空白生物基質中加入待測藥物）考查考查方法效能指標方法效能指標;(3);(3)實際樣品實際樣品(Incurre(Incurre samples)samples)測試測試代謝產(chǎn)物的干擾代謝產(chǎn)物的干擾( (方法特異性方法特異

23、性) )v 二二 分析方法驗證分析方法驗證(validation)(validation) 用于實際生物樣品分析之前驗證分析方法的用于實際生物樣品分析之前驗證分析方法的可行性與可靠性可行性與可靠性（一）方法特異性（一）方法特異性specificityspecificity( (專屬性或選擇性專屬性或選擇性selectivityselectivity) )系指當有內源性物質存在時，方法準確測定待系指當有內源性物質存在時，方法準確測定待測物質的能力測物質的能力專屬性：表示所檢測的信號專屬性：表示所檢測的信號( (響應響應) )系屬于待測系屬于待測藥物所特有的能力。藥物所特有的能力。選擇性：系指將待

24、測物質與其代謝物及同服的選擇性：系指將待測物質與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分其它藥物加以區(qū)分( (分離分離) )的能力。的能力。特異性：函蓋二者，以驗證所測定的物質與待特異性：函蓋二者，以驗證所測定的物質與待測藥物的同一性。測藥物的同一性。 1. 1. 內源性物質的干擾內源性物質的干擾 考查考查待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號 比較對照品（或標準品），空白生物基質，比較對照品（或標準品），空白生物基質，模擬生物樣品（空白生物基中加對照品）信號。模擬生物樣品（空白生物基中加對照品）信號。如如HPLCHPLC色譜峰的色譜峰的t tR R、n n和和T T是否一致

25、，是否一致， 及與內源性物質色譜峰的及與內源性物質色譜峰的R R 確證：內源性物質對分析方法有無干擾確證：內源性物質對分析方法有無干擾2. 2. 代謝產(chǎn)物的干擾代謝產(chǎn)物的干擾 比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號與代謝產(chǎn)物的檢測信號與代謝產(chǎn)物的R R值值。確證：其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾確證：其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾 結構已知的特定活性代謝物的測定結構已知的特定活性代謝物的測定必要時通過必要時通過HPLC-DADHPLC-DAD或或LC-MSLC-MS確證色譜峰的單純確證色譜峰的單純性和同一性性和同一性 對于結構未知的代謝產(chǎn)物的測定

26、，可采用對于結構未知的代謝產(chǎn)物的測定，可采用LC-LC-LC-NMRLC-NMR進行結構的初步推測后，考察其干擾情況。進行結構的初步推測后，考察其干擾情況。3. 3. 伍用藥物的干擾伍用藥物的干擾 進行進行TDMTDM時，還要考慮患者可能同時服用藥物時，還要考慮患者可能同時服用藥物( (通常為數(shù)有限通常為數(shù)有限) )的干擾。的干擾。 比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號物樣品的檢測信號確證：同時服用藥物對分析方法的干擾情況確證：同時服用藥物對分析方法的干擾情況4. 4. 與參比方法的相關性與參比方法的相關性 參比方法一般選用特異性強、準確

27、度高、線性參比方法一般選用特異性強、準確度高、線性關系良好的色譜法關系良好的色譜法 如在如在TDMTDM中使用中使用UV(UV(或或RIA)RIA)時時, , 可以用可以用HPLC(HPLC(或或GC)GC)為參比；以參比方法測定結果為橫坐標為參比；以參比方法測定結果為橫坐標(X); (X); 擬擬定方法測定結果為縱坐標定方法測定結果為縱坐標(Y)(Y)用最小二乘法計算回歸方程用最小二乘法計算回歸方程 Y Ya abXbX ( (坐標標坐標標度相等度相等) )和相關系數(shù)和相關系數(shù)( (r r) )表示兩種方法測得結果表示兩種方法測得結果的一致性。的一致性。 Y Ya abXbX 截距截距(a)

28、(a)：表示擬定方法受到恒定干擾的程度：表示擬定方法受到恒定干擾的程度：內源性物質內源性物質(UV)(UV) 斜率斜率(b)(b)：表示擬定方法受到比例干擾的程度：表示擬定方法受到比例干擾的程度：標記抗原不純標記抗原不純(RIA)(RIA) 與參比方法的相關性比較與參比方法的相關性比較: :除顯示分析方法的特除顯示分析方法的特異性外異性外, ,斜率斜率b b表示兩種方法測得結果的一致性表示兩種方法測得結果的一致性 若截距若截距a0, a0, 則擬定方法的準確度則擬定方法的準確度( (回收率回收率) )為為100b(%)100b(%)（二）標準曲線和定量范圍（二）標準曲線和定量范圍 標準曲線標準

29、曲線(standard curve)(standard curve)，oror叫校正曲線叫校正曲線(calibration curve)(calibration curve)，or working curveor working curve生物樣品中所測定藥物濃度與響應的相關性生物樣品中所測定藥物濃度與響應的相關性 通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標準曲線通常除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標準曲線通常為線性模式為線性模式回歸分析法為最小二乘法（回歸分析法為最小二乘法（least squaresleast squares）或加

30、權最小二乘法（或加權最小二乘法（weighted least squaresweighted least squares11使用與待測樣品相同的生物介質。使用與待測樣品相同的生物介質。22標準曲線點數(shù)標準曲線點數(shù)66，線性線性范圍包含全部待測濃度。范圍包含全部待測濃度。v 3. 3.標準曲線的高低濃度范圍叫定量（線性）范圍標準曲線的高低濃度范圍叫定量（線性）范圍（quantification rangequantification range），應能覆蓋全部生物樣品），應能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度中的藥物濃度v 4.4.以待測藥物的檢測響應以待測藥物的檢測響應( (如色譜峰面積或峰高如色譜

31、峰面積或峰高) ) 或與內標物質的檢測響應的比值或與內標物質的檢測響應的比值( (內標法內標法)()(因變量因變量,y),y)對標準樣品中藥物濃度對標準樣品中藥物濃度( (自變量自變量, ,x x) )，進行線性回歸，進行線性回歸，求得回歸方程求得回歸方程(y(ya abxbx) )及其相關系數(shù)及其相關系數(shù)( ( ) )，最高，最高濃度應高于達峰濃度濃度應高于達峰濃度( (C Cmaxmax) )；最低濃度應低于；最低濃度應低于C Cmaxmax的的10%10%5%5%，并應為方法的，并應為方法的LOQLOQ，回歸方程的截距應接近，回歸方程的截距應接近于零，相關系數(shù)要求于零，相關系數(shù)要求 0.

32、99(0.99(色譜法色譜法) )或或0.98(0.98(生生物學方法物學方法) )5.5.標準系列模擬生物樣品的制備標準系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質空白生物基質( (如血漿如血漿)加入標準系列溶液加入標準系列溶液適量，渦旋混勻，防止在標準溶液加入及渦旋混合適量，渦旋混勻，防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成損失時造成損失 先加入標準溶液先加入標準溶液 再加入空白生物基質再加入空白生物基質 渦旋混勻渦旋混勻 v （三）定量下限（三）定量下限（LLOQLLOQ）v 標準曲線上的最低濃度點，表示方法的靈敏度標準曲線上的最低濃度點，表示方法的靈敏度（sensitivitysensitivity

33、），即測定樣品中符合準確度和精），即測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。密度要求的最低藥物濃度。v 應能滿足測定應能滿足測定3 35 5個消除半衰期后生物樣品中個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度的藥物濃度v 準確度在準確度在80%80%120%(120%(或或RERE在在20%20%的范圍內的范圍內) )vRSDRSD應應20%20% （四）精密度（四）精密度precisionprecision與準確度與準確度accuracyaccuracy 高中低高中低三個濃度的三個濃度的QCQC樣品，樣品，LOQLOQ附近，標準曲線附近，標準曲線上限及中間各一個濃度各上限及中間各一個濃度各5

34、5個樣。個樣。 日內，日間精密度的日內，日間精密度的RSDRSD15%15%，LOQLOQ附近附近20%20%，加，加樣回收率樣回收率85115%,LOQ85115%,LOQ附近附近80120%80120%。準確度以準確度以測定值測定值M M (measured)(measured)的平均值與理論濃度的平均值與理論濃度( (加入值加入值) )A A(added)(added)的比值表示的比值表示相對回收率相對回收率相對誤差相對誤差 限度要求限度要求: :相對回收率應在相對回收率應在85%85%115% (LOQ115% (LOQ附近附近80%80%120%),RE120%),RE在在15% (

35、LOQ15% (LOQ附近為附近為20%)20%)）（%100AMRR）（）（%100%100RRAAMRE方法精密度一般用標準偏差方法精密度一般用標準偏差(standard deviation(standard deviation，SDSD) )或相對標準偏差或相對標準偏差(relative standard deviation(relative standard deviation，RSDRSD) )表示表示 SDSD= =RSDRSD= = = = 包括批內包括批內(within-run(within-run或或intra-assay)intra-assay)RSDRSD( (日內日內)

36、 ) 和批間和批間(between-run(between-run或或inter-assay)inter-assay)RSDRSD( (日間日間) )112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniii方差分析法方差分析法 批間批間RSDRSD = =批內批內RSD RSD = = =(%)1001)(%)100112 XIXXnXISSIiiA）（%100(%)100 XINSSSSXINSSAtote）（）（%100)(11212 XINXXnXXIiIiinjijv SS SSe e：批內方差；：批內方差；SSSSA A：批間方差；：批間方差；SSSStottot：總

37、方：總方差；差；X Xijij：第：第i i批第批第j j次測定；次測定；X Xi i.:.:第第i i批批n n次測定平均次測定平均值值; X:N; X:N次測定總平均值次測定總平均值;I:;I:測定批數(shù)測定批數(shù);n:;n:每批測定每批測定次數(shù)次數(shù);N:;N:總測定次數(shù)總測定次數(shù)( (五）五）樣品穩(wěn)定性樣品穩(wěn)定性 室溫及冷凍下，測室溫及冷凍下，測A A（吸收度或峰面積）以考（吸收度或峰面積）以考察不同條件下，樣品的可保存時間及穩(wěn)定性察不同條件下，樣品的可保存時間及穩(wěn)定性 QCQC樣品穿插于實際樣品測定全過程樣品穿插于實際樣品測定全過程模擬模擬( (或實際或實際) )生物樣品及其預處理后的待測溶生物樣品及其預處理后的待測溶液進行考察液進行考察 要求：準確度要求：準確度85%85%115%(115%(RERE在在15%15%范圍內范圍內) )，RSDRSD15% 15% （六）（六）提取提取回收率（回收率（extraction recoveryextraction recovery） 考察樣品處理過程的回收率考察樣品處理過程的回收率 重現(xiàn)性好重現(xiàn)性好 v提取回收率一般應提取回收率一般應50%50%v高、中濃度的高、中濃度的RSDRSD應應15%15%v低濃度的低