荊芥揮發(fā)油對LPS所致大鼠急性肺損傷模型肺組織中NF-κB IκB

1、荊芥揮發(fā)油對LPS所致大鼠急性肺損傷模型肺組織中NF-B， IB，                          作者：解宇環(huán) 沈映君 金沈銳 徐世軍【摘要】  目的觀察荊芥揮發(fā)油（VOHS）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）大鼠模型肺組織中核因子-B(NF-B)，IB-，IL1-和TNF-含量的影響，探討荊芥揮發(fā)油抗炎作用

2、的細(xì)胞信號調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組，模型對照組，陽性對照組（地塞米松），荊芥揮發(fā)油高、中、低劑量組。尾靜脈注射LPS(1.0 mg/kg體重)或生理鹽水，6h后處死動物，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定肺組織NF-B p65、磷酸化IB-、IL1-和TNF-含量。結(jié)果與模型對照組比較，VOHS高、中、低劑量組均可顯著降低大鼠肺組織中的NF-B p65和磷酸化IB-含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05， P<0.01, P<0.001），同時VOHS各劑量組也可顯著降低大鼠肺組織中IL1-和TNF-含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.

3、01，P<0.001）。結(jié)論荊芥揮發(fā)油抗炎作用機(jī)制之一可能是抑制IB-磷酸化降解和NF-B活性，進(jìn)而減少炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL1-，TNF-的合成和釋放。 【關(guān)鍵詞】  急性肺損傷 脂多糖 荊芥揮發(fā)油 抗炎機(jī)制Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of  the volatile oil of Herba Schizonepetae on level ofNF-B , IB， IL1- and TNF- in  lung  tissue of  ALI rats induced by LP

4、S ,so to explore the modulator mechanisms of  the volatile oil of Herba Schizonepetae in  signal transduction of inflammation. MethodsSixty male rats were randomly divided into six groups: normal control group, model group,LPS+Dex group and three volatile oil of Herba Schizonepetae groups.

5、 LPS was injected intravenously to prepare ALI model. The level of NF-B ,IB , IL1- and TNF- in lung homogenates were measured by ELISA. ResultsThe level of NF-B in rat lungs significantly increased after LPS stimulation than that of the normal group (P<0.05， P<0.01, P<0.001); the Volatile o

6、il of Herba Schizonepetae groups could decrease the level of NF-B  ,IB , IL1- and TNF- in rat lungs of the model groups（P<0.01，P<0.001）.ConclusionThe volatile oil of Herba Schizonepetae can inhibit the IB- phosphorylation and NF-B activivty, then reduce the synthetise and release of cytok

7、ines(IL1-,TNF-). This may be one of the mechanism that  VOHS has the effect of anti-inflammation .Key words:Acute lung injury;  Lipopolysaccharide;  The volatile oil of Herba Schizonepetae;  Mechanism of anti-inflammation荊芥為常用解表藥，前期的實驗已經(jīng)證實其揮發(fā)油對多種炎癥動物模型均具有良好的抗炎作用1,2。核因子-B對前炎癥因子IL1

8、和TNF的基因表達(dá)調(diào)節(jié)起重要作用,而NF-B的活化受NF-B抑制蛋白IB的調(diào)控3，荊芥揮發(fā)油能否通過干預(yù)NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑達(dá)到抗炎作用，目前尚無研究報道。本研究應(yīng)用脂多糖（LPS）復(fù)制大鼠急性肺損傷（ALI)模型，通過觀察荊芥揮發(fā)油 (VOHS) 對大鼠肺組織中核因子B p65，IB-，IL1-和TNF-含量的影響進(jìn)一步探討荊芥揮發(fā)油抗炎作用機(jī)制。1  材料1.1  荊芥揮發(fā)油荊芥(Herba Schizonepetae)購自成都市中藥材公司，由我校中藥鑒定教研室王光志博士鑒定符合現(xiàn)行藥典藥用標(biāo)準(zhǔn)，按中國藥典2005版部附錄D揮發(fā)油測定法中甲法提取，得淡黃色澄明油狀液體，

9、氣味芳香，揮發(fā)油含量為1.2%，無水硫酸鈉充分脫水后，密閉貯存于棕色瓶中,4冰箱保存?zhèn)溆?，實驗時用0.5%吐溫-80溶液配制使用。前期實驗測得VOHS小鼠灌胃給藥LD50為1.10 ml/kg，實驗中所用VOHS劑量約為LD50的1/10,1/20,1/40。1.2  動物健康SD雄性大鼠（SPF級），體重180220 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK（川）2004-12。1.3  試劑LPS（E. Coli 0111：B4）Sigma公司產(chǎn)品；地塞米松磷酸鈉注射液，西南藥業(yè)股份有限公司，批號66040099；Rat NF-B p65 ELISA

10、 Kit， Rat IB- ELISA Kit，批號0504； Rat IL1-ELISA Kit，批號0509；Rat TNF- ELISA Kit，批號0509，以上均由上?？党缮镉邢薰咎峁?。1.4  儀器Multiskan MK3酶標(biāo)儀, Thermo公司；JY96-超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科器研究所。2  方法與結(jié)果2.1   LPS致大鼠ALI模型的制備取SD雄性大鼠（SPF級）60只，按體重分層，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組（地塞米松），VOHS高、中、低劑量組，每組10只。除陽性對照組第5天予地塞米松腹腔注射1次給藥外，

11、其他組均連續(xù)灌胃給藥5 d，1次/d，空白對照組和模型對照組灌相同體積的生理鹽水。末次給藥后1 h，每鼠尾靜脈注射LPS 1.0 mg/kg體重，6 h后處死動物，在無菌條件下取出肺臟，用無菌濾紙吸干肺臟表面的血液后錫箔紙包裹，-70保存。2.2  肺組織總蛋白的抽提及指標(biāo)的檢測稱取肺組織250 mg,并加入預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，以超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)低速粉碎細(xì)胞，低溫冷凍離心14 000 r/min,15 min后，取上清液，按BCA法測定蛋白濃度。用ELISA Kit，參照試劑盒說明測定活化的NF-B p65和磷酸化的IB-以及IL1-,TNF-含量：采用雙抗體夾心法。酶標(biāo)板上已包被

12、捕獲抗體。待測樣品加入微孔孵育后加檢測抗體孵育，隨后加HRP偶聯(lián)的抗小鼠二抗，最后加TMB顯色。酶標(biāo)儀450 nm處讀OD值，OD值大小與蛋白的量成正比。2.3  統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)均以±s表示,統(tǒng)計采用單因素方差分析（ANOVA）。1         2.4  結(jié)果3  討論急性肺損傷(ALI)是臨床常見的危重病癥, 其病理基礎(chǔ)是由多種炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)介導(dǎo)的肺臟局部炎癥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)失控所致的肺毛細(xì)血管膜損傷，是多器官功能障礙綜合征(MODS)或

13、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)中最常出現(xiàn)的一種器官組織損傷4。革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分脂多糖(LPS)具有明顯的致ALI作用5。LPS可引起中性白細(xì)胞(PMN)在肺內(nèi)聚集、激活,黏附于內(nèi)皮細(xì)胞,釋放氧自由基、蛋白水解酶等而參與ALI的發(fā)生6。研究表明，LPS的這些作用是通過一系列細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的7，其中NF-B信號通路是與機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)最為密切的相關(guān)的信號通路。NF-B是一種幾乎存在于所有真核細(xì)胞中的核因子,對細(xì)胞的生長、分化、黏附、凋亡及炎癥反應(yīng)等具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。典型的NF-B復(fù)合體由兩個亞單位P50、P65/c-Rel組成，并主要通過與其抑制蛋白IB緊密結(jié)合以無活性

14、的形式存在于細(xì)胞漿中。外源性損傷或毒性物質(zhì)(如細(xì)菌毒素)都可誘導(dǎo)NF-B的活化，進(jìn)而調(diào)控免疫炎性基因的轉(zhuǎn)錄8。細(xì)菌LPS通過與血漿中急性期蛋白的脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)形成LPS-LBP復(fù)合物,后者能與單核-巨噬細(xì)胞膜上的CD14受體緊密結(jié)合。但是,CD14為糖基化磷脂酰肌醇膜蛋白,錨定在細(xì)胞膜上,無胞內(nèi)區(qū)不能獨立進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)9。近年研究已經(jīng)證實,TOLL樣受體(toll-likereceptor,TLR)4在CD14和LBP存在時可作為LPS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,使TLR4聚合而活化,通過其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域募集細(xì)胞內(nèi)髓樣分化蛋白88(MyD88)和IL1受體相關(guān)激酶發(fā)生自身磷酸化,引發(fā)酶系級聯(lián)反應(yīng),使I

15、B磷酸化與NF-B解離。正常時，NF-B的P50、P65亞基與抑制性亞基IB形成三聚體存在于胞漿中。IB磷酸化后被非特異性蛋白酶水解，從而使RelA蛋白的核定位信號暴露，導(dǎo)致NF-B被激活后轉(zhuǎn)位入核,活化后其亞基p50、p65由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與其目的靶基因的啟動子或增強(qiáng)子上特定的B系列特異結(jié)合，啟動和調(diào)控一系列參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子基因表達(dá)（如促炎細(xì)胞因子、黏附分子、環(huán)氧化酶等）從而介導(dǎo)多種炎癥性疾病的產(chǎn)生8 。  在機(jī)體對組織損傷和感染的炎癥反應(yīng)中，炎性細(xì)胞因子(IL1-、TNF-等）介導(dǎo)的反應(yīng)是創(chuàng)傷、感染反應(yīng)的基本部分，但在炎癥免疫反應(yīng)過程，機(jī)體在重度感染時，在內(nèi)毒素刺激下

16、過量釋放IL1-、TNF-，進(jìn)一步激活多形核白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)，形成瀑布效應(yīng)10，從而導(dǎo)致多臟器功能障礙及衰竭11,12，如能阻斷炎性細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，則能阻止損害性炎癥反應(yīng)的發(fā)生和。本研究證實， LPS刺激后，大鼠肺組織中NF-BP65、磷酸化IB-、IL1-和TNF-含量顯著升高，這說明LPS可能通過NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活而誘導(dǎo)肺損傷。而VOHS給藥各組大鼠肺組織中NF-B和磷酸化IB-含量顯著減少，同時IL1-和TNF-水平顯著降低?？梢奦OHS可通過抑制IB的磷酸化，保護(hù)IB免于降解，而影響IB-與NF-B的解離，減少NF-B轉(zhuǎn)位、入核，并啟動炎癥因子相

17、關(guān)基因，從而減少炎癥因子IL1-、TNF-表達(dá)，減輕肺組織損害。因此我們推測，VOHS抑制NF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活，進(jìn)而減少炎癥介質(zhì)的合成和釋放，是其抗炎的作用機(jī)制之一。關(guān)于VOHS對NF-B信號通路具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?！尽?#160; 1曾 南，沈映君，劉旭光，等.荊芥揮發(fā)油抗炎作用研究J.中藥藥理與臨床,1998,14(6)：24.2沈映君.中藥解表方藥研究，第1版M.北京:醫(yī)藥科技出版社，2004:231.3Jarvis MA, Borton JA, Keech AM, et al .Human cytomegalovirus attenuates interleuki

18、n-1beta and tumor necrosis factor alpha proinflammatory signaling by inhibition of NF-kappaB activationJ.Virol. 2006，80(11):5588.4張君嵐,劉艷梅,王殿華,等.IL1-10抗內(nèi)毒素氣管內(nèi)滴注急性肺損傷作用的實驗研究J.中國病理生理雜志,2000,16(4):324.5金惠銘.病理生，第5版M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000：219.6Tsuji C, Minhaz MU,Shioya S, etal.The importance of polymorphonuclea

19、r leukocytes in lipopolysaccharide-induced superoxide anion production and lung injury: ex vivo observation in rat lungsJ.Lung, 1998,176(1):1.7楊一新，李桂源.LPS所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展J.中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，31(1):141.8邢飛躍，趙克森，姜 勇.NF-KB信號通路與阻斷策略J.中國病理生理雜志，2003，19(6)：849.9Orange JS, Geha RS. Finding NEMO: genetic disorders of NF