食品中大腸菌群的測定資料

1、食品中大腸菌群的檢驗與食品中大腸菌群的檢驗與分析分析參考參考 GB47893-20101、了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。群測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。2、練習并掌握大腸菌群的檢驗方法、練習并掌握大腸菌群的檢驗方法。一、一、 目的目的二、原理二、原理1 1、大腸菌群、大腸菌群大腸菌群系指一群在大腸菌群系指一群在3737、2424小時能發(fā)酵乳小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌無芽孢桿菌。主要由腸桿菌科中主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的

2、一部分及沙門氏屬屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的的亞屬細菌亞屬細菌組成。組成。該菌主要來源于該菌主要來源于人畜糞便人畜糞便，故以此作為糞便污，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每食品中大腸菌群數(shù)系以每1 1g（或（或mL）檢樣內(nèi)大腸）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)菌群最可能數(shù)MPNMPN（themostprobablenumber-簡稱簡稱MPN）

3、表示）表示2 2、測定的意義、測定的意義3大腸桿菌的生物學特性大腸桿菌的生物學特性基本形態(tài)：基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過根，一般不超過10根，根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。著色良好，革蘭氏染色陰性。 在普通營

4、養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 。三三、材料材料1 1、食品樣品、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調(diào)味品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品?；蚱渌称?。2 2、陽性對照菌、陽性對照菌大腸桿菌大腸桿菌除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，除微生物實驗

5、室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：其他設備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、 均質(zhì)器、振蕩均質(zhì)器、振蕩器、器、無菌吸管無菌吸管或微量移液器及吸頭、或微量移液器及吸頭、無菌錐無菌錐形瓶形瓶、無菌培養(yǎng)皿無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器菌落計數(shù)器等。等。3、儀器設備儀器設備月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST LST ）肉湯）肉湯、 煌綠乳煌綠乳糖膽鹽（糖膽鹽（BGLB BGLB ）肉湯）肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA )VRBA ) 、無菌生理鹽水無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、或磷酸鹽緩沖液、1mol/L1mol/L氫氧化鈉氫氧化鈉（

6、NaOH ) NaOH ) 、 1mol/L 1mol/L 鹽酸鹽酸（HCI )HCI ) 。 4 4、 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑第一法第一法 大腸菌群大腸菌群MPNMPN計數(shù)法。計數(shù)法。第二法第二法 大腸菌群平板計數(shù)法。大腸菌群平板計數(shù)法。四、四、 檢驗方法檢驗方法試驗流程試驗流程1 1、樣品的稀釋、樣品的稀釋（1 1） 固體和半固體樣品固體和半固體樣品u稱取稱取25g25g 樣品，放入盛有樣品，放入盛有225ml225ml磷酸鹽緩沖液或生理磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min-10000r/min 8 000r/min-10000r/min 均均質(zhì)

7、質(zhì)1 min-2 min 1 min-2 min ，或放入盛有，或放入盛有225ml225ml磷酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 1 min-2 min min-2 min ，制成，制成1:101:10 的樣品勻液。的樣品勻液。第一法第一法 大腸菌群大腸菌群MPNMPN計數(shù)法計數(shù)法（2 2） 液體樣品液體樣品以無菌吸管吸取以無菌吸管吸取25m25mL L樣品，置盛有樣品，置盛有225m225mL L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻

8、璃珠）中，充分棍勻，制成玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:101:10 的樣品勻液。的樣品勻液。（3 3） 樣品勻液的樣品勻液的pH pH 值應在值應在6.5-7.56.5-7.5 之間，必之間，必要時分別用要時分別用1mol/L 1mol/L 氫氧化鈉（氫氧化鈉（NaOH NaOH ）或）或1 1 mol/L mol/L 鹽酸（鹽酸（HCI HCI ）調(diào)節(jié)。）調(diào)節(jié)。（4 4） 用用1m1mL L無菌吸管或微量移液器吸取無菌吸管或微量移液器吸取1:101:10 樣品勻液樣品勻液1m1mL L，沿管壁緩緩注入，沿管壁緩緩注入9m9mL L磷酸鹽緩沖磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭液

9、或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 1 支支1m1mL L無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:1001:100 的樣品勻液。的樣品勻液。（5 5）、）、 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成操作，依次制成1010倍遞增系列倍遞增系列稀釋樣品勻液。每稀釋樣品勻液。每遞增稀釋遞增稀釋1 1 次，換用次，換用1 1 支支1m1mL L無菌吸管或吸頭。無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全

10、過程不得超過過15 min15 min 。每個樣品，選擇每個樣品，選擇3 3 個個適宜的適宜的連續(xù)稀釋度連續(xù)稀釋度的樣品勻的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 3 管管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LSTLST）肉湯）肉湯，每管接種，每管接種1m1mL L（如接種量超過（如接種量超過1m1mL L，則用雙料，則用雙料LSTLST肉湯）肉湯）, , 36361 1 培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h2 2h h ，觀察倒管內(nèi)是否有氣，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h48h2h 2h 。2 2、

11、 初發(fā)酵試驗初發(fā)酵試驗記錄在記錄在24h 24h 和和48h 48h 內(nèi)產(chǎn)氣的內(nèi)產(chǎn)氣的LST LST 肉湯管數(shù)。肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復產(chǎn)氣者則進行復發(fā)酵試驗發(fā)酵試驗。用接種環(huán)從所有用接種環(huán)從所有48h48h2h 2h 內(nèi)內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的發(fā)酵產(chǎn)氣的LST LST 肉湯肉湯管中分別取培養(yǎng)物管中分別取培養(yǎng)物l l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB( BGLB）肉湯管中，肉湯管中，36361 1 培養(yǎng)培養(yǎng)48h48h2h2h ，觀察產(chǎn)氣情況。觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。3 3、 復發(fā)酵試驗復發(fā)酵試

12、驗根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN MPN 表（見附錄表（見附錄B ) B ) ，報告，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN MPN 值值。注意：注意：當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也應相應減少或增加。的數(shù)也應相應減少或增加。 4 4、 大腸菌群最可能數(shù)（大腸菌群最可能數(shù)（MPN MPN ）的報告）的報告大腸桿菌大腸桿菌0157顯色顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上的菌落的菌落在伊紅美蘭乳糖在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上）上大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征

13、 典型菌落為紅典型菌落為紅色色 , 菌落周圍菌落周圍有紅色的膽鹽有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落沉淀環(huán)。菌落直徑為直徑為 2-3mm 或更大?；蚋?。 大腸菌群在結晶紫中性紅瓊脂大腸菌群在結晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上典型特征上典型特征 典型菌落為紫典型菌落為紫紅色紅色 , 菌落周菌落周圍有紅色的膽圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為落直徑為 0.5mm 或更或更大。大。 大腸桿菌在大腸桿菌在MFC瓊脂上的典型特征瓊脂上的典型特征試驗流程試驗流程1 1、 樣品的稀釋樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進行。按第一法中的稀釋方法進行。（1 1） 選取選取2 2個個3 3個適宜的連續(xù)稀釋度個適宜的連續(xù)稀

14、釋度，每個稀釋，每個稀釋度接種度接種兩個無菌平皿兩個無菌平皿，每皿每皿1m1mL L。同時分別取。同時分別取1m1mL L生生理鹽水加入兩個無菌平皿理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照作空白對照。（2 2） 及時將及時將15 mL-20m15 mL-20mL L冷至冷至46 46 的的結晶紫中性結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（紅膽鹽瓊脂（VRBA VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，后，再加再加3 mL-4m3 mL-4mL LVRBAVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板，覆蓋平板表層。翻轉平板，

15、置于置于3636l l 培養(yǎng)培養(yǎng)18h-24h 18h-24h 。2 2、 平板計數(shù)平板計數(shù)（3 3） 平板菌落數(shù)的選擇平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在1515-150-150 之間的平板，分別計數(shù)之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典典型菌落型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 0.5 mm 或更大?；蚋?。2、平板計數(shù)平板計數(shù)（4 4）、）、 證實試驗證實試驗 從從VRBA VRBA 平板上挑取平板上挑取10 10 個個不同類型的不同類型的典型和典型

16、和可疑菌落可疑菌落，分別移種于，分別移種于BGLBBGLB 肉湯管內(nèi)，肉湯管內(nèi)，36361 1 培養(yǎng)培養(yǎng)24h-48h24h-48h ，觀察產(chǎn)氣情況。凡，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB BGLB 肉湯管肉湯管產(chǎn)氣產(chǎn)氣，即可報告為，即可報告為大腸菌群陽性大腸菌群陽性。2、平板計數(shù)平板計數(shù)（5 5）大腸菌群平板計數(shù)的報告）大腸菌群平板計數(shù)的報告 經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3 3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。2、平板計數(shù)平板計數(shù)例：例：1

17、0-4樣品稀釋液樣品稀釋液1 mL，在，在VRBA平板上平板上有有100個典型和可疑菌落，挑取個典型和可疑菌落，挑取 其中其中10個接種個接種BGLB肉湯管，證實有肉湯管，證實有6個陽個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。）。國標國標4789.3的的08版與版與03版主要不同版主要不同1 1、名稱更改、名稱更改 以以大腸菌群計數(shù)大腸菌群計數(shù)代替原來的代替原來的大腸菌群測定。大腸菌群測定。2 2、增加增加了大腸菌群的了大腸菌群的平板計數(shù)法和紙片檢測法。平板計數(shù)法和紙片檢測法。3 3、大腸菌群的、大腸菌群

18、的MPNMPN法以法以乳糖為主乳糖為主改為以改為以月桂基硫月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（酸鹽胰蛋白胨（LSTLST）肉湯為主）肉湯為主的要培養(yǎng)基的的要培養(yǎng)基的MPNMPN法。法。4 4、大腸菌群的、大腸菌群的MPNMPN法中原法中原“報告每報告每100 ml 100 ml （或（或g g）大腸菌群的大腸菌群的MPNMPN值值”改為改為“報告每報告每1 ml 1 ml （或（或1g1g）大腸菌群的大腸菌群的MPNMPN值值”。比較區(qū)別比較區(qū)別GB/T4789.38 - 2008大腸桿菌的計數(shù)大腸桿菌的計數(shù)03版版流程流程一、一、步驟步驟取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法相同

19、相同，做成做成1:10的均勻稀釋液為檢樣。的均勻稀釋液為檢樣。同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時接同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用大腸埃希氏種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照。1、乳糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗根據(jù)食品衛(wèi)生要求或對檢樣污染程根據(jù)食品衛(wèi)生要求或對檢樣污染程度的估計，選擇度的估計，選擇三個稀釋度三個稀釋度，每個稀釋，每個稀釋度接種度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。 接種量在接種量在1ml以上者以上者，用用雙料乳糖膽鹽雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用單料乳糖膽鹽單料乳糖膽鹽

20、發(fā)酵管發(fā)酵管，同時用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌，同時用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種混合接種于混合菌種混合接種于1支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵管對照。管對照。置置361溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)242小時小時，如所有如所有發(fā)酵管都發(fā)酵管都不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣，則可報告為則可報告為大腸菌群大腸菌群陰性陰性，如如有產(chǎn)氣者有產(chǎn)氣者，則與對照的混合菌則與對照的混合菌種一起種一起按下列程序進行按下列程序進行。2、分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在伊紅美蘭瓊脂伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板上劃線分離。然后置瓊脂）平板上劃線分離。然后置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824小時小時后取出后取

21、出，觀察觀察菌落形態(tài)菌落形態(tài)，并作并作革蘭氏染色革蘭氏染色和和證實證實試驗試驗?？梢删涮攸c：可疑菌落特點：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。中心色較深的淡紫黑色菌落。3、證實試驗證實試驗在上述平板上挑取可疑大腸菌落在上述平板上挑取可疑大腸菌落12個進行個進行革蘭氏染色革蘭氏染色，同時接種同時接種乳糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵管管，置置361溫箱培養(yǎng)溫箱培養(yǎng)242小時小時,觀察觀察產(chǎn)氣情況產(chǎn)氣情況，凡凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為即可報告為大腸大

22、腸菌群陽性菌群陽性。 4、報告報告根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每表，報告每100ml（g）大腸菌群的）大腸菌群的MPN值。值。 二、結果二、結果根據(jù)證實大腸菌群的陽性管數(shù)根據(jù)證實大腸菌群的陽性管數(shù)，查查MPN檢索表檢索表(見附錄見附錄)報告每報告每100ml(克克)大大腸菌群的最可能數(shù)腸菌群的最可能數(shù)。三、注意事項三、注意事項1、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗是樣品的、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結果，發(fā)酵結果，不是純菌的發(fā)酵試驗不是純菌的發(fā)酵試驗，初發(fā)，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會有相

23、當多的合格樣品性。只做一步，會有相當多的合格樣品作為不合格處理，應注意。作為不合格處理，應注意。 2、膽鹽膽鹽可抑制可抑制革蘭氏革蘭氏陽性菌的生長，陽性菌的生長，有利于大腸桿菌的生長繁殖。有利于大腸桿菌的生長繁殖。 3 3、接種量在、接種量在1ml以上者以上者，用用雙料雙料乳糖膽乳糖膽鹽發(fā)酵管鹽發(fā)酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用單料單料乳糖膽乳糖膽鹽發(fā)酵管。鹽發(fā)酵管。 4、大腸菌群菌落在、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上瓊脂上大多呈大多呈紫紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應。應取典型菌落，取典型菌落，如無應多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。如無應多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。 一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且且革蘭氏染色革蘭氏染色為陰性，可做出判定。為陰性，可做出判定。 5、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣的發(fā)酵管、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，如有氣泡沿管壁上升，應考慮有氣體產(chǎn)如有氣泡沿管壁上升，應考慮有氣體產(chǎn)生，做進一步試驗。生，做進一步試驗。 6、 MPN檢索表是采用三個稀釋檢索表是采用三個稀釋度九管法，較理想的結果是度九管法，較理想的結果是最低最低3管為陽性管為陽性，最高最高3管為陰性管為陰性。如無法估測樣品中的菌數(shù)。如無法估測樣品中的菌數(shù)時，應做一定范圍