雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗的研究.docx

1、雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗的研究收稿日期：2009-09-17修回日期：2009-10-20公金項(xiàng)0:科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新*.（00026231101115）秦玉明，王利永，朱良全，王棟（中國(guó)善醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）摘要：應(yīng)用雞傳染性支氣管炎病毒（H%株）與不同耐熱保護(hù)劑配方和凍干曲線進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：采用凍干曲線2和耐熱保護(hù)劑WXS凍干雞傳染性支氣管炎病毒Hu弱毒疫苗效果最佳。試制耐熱活疫苗3批，其各項(xiàng)檢驗(yàn)均符合要求。耐老化試臉表明：經(jīng)過(guò)371放置10d的每羽份病毒含量下降0.0.8個(gè)滴度，每羽份病毒含量達(dá)10"1（戶EID*保存期試驗(yàn)表明:281:保存24個(gè)月

2、疫苗每羽份病毒含量下降0.4-0.6個(gè)滴度，每羽份病毒達(dá)EIDo疫苗28P保存24個(gè)月后效檢抗體水平達(dá)到1：1A1：32。免疫持續(xù)期試臉表明：免疫21日齡SPF雞，6個(gè)月后血清中和抗體效價(jià)達(dá)到1：321：6牝田間試驗(yàn)表明臨床觀察無(wú)不良反應(yīng)，安全有效。特異性試驗(yàn)表明耐熱活疫苗抗原性不變。耐熱保護(hù)劑生物學(xué)和理化特性表明保護(hù)劑安全、穩(wěn)定，室溫保存期達(dá)3個(gè)月。關(guān)鍵詞：耐熱保護(hù)劑；雞傳染性支氣管炎病毒（H於株）；活疫苗StudyonThermo-tolerantLivingVaccineofAvianInfectiousBronchitis*QINYuming,WANGLiyong.ZHULiangqu

3、an,WANGDong*通訊作者,Email：wangdongQINYuming,WANGLiyong.ZHULiangquan,WANGDong*通訊作者,Email：wangdong(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081)Abstract：Avianinfectiousbronchitisvirus(IBV)attenuatedstrain(HJ2)wasselectedbyfreeze-dryingexperimentsblendingwithdifferentsuspendingmediaandlyophilizatio

4、ncurves.Tlie1BVattenuatedstrain(H>j)choosedbyWXSandlyophilizationcurve2wasmostfavorable.Threebatchesofthermo-tolerantlivingvaccineofIBV(HQproducedbyWXSandlyophilizationcurve2weretestedeligible.Theheat-resistingtestshowedthatthetiterofvirusreduced0.6to0.8EIDjoperdoseafterstoringat37幻for10daysandst

5、illremainedIO47to10s1EID”perdose.Theexperimentofthepreserverperiodreflectedthatthetiterofvimsreduced0.4to0.6EIDperdoseafterstoringat4°Cfor24monthsandstillremained10*1toIO41EID”perdose.Thetiterofneutralizationseraantibodyremained1：I6to132afterstoringat2to8丁for24months.Theimmunitylastingtestindic

6、atedthatimmunizingSPFchickensat21daysage,thetiterofneutralizationseraantibodyreached132to1：64after6months.Thefieldlestshowedthatthermo-lolcrantlivingvaccineofIBV(H52)wassafeandeffective.ThespecificitytestshowedthatinfectiousbronchitisstandardpositiveserumcanspeciallyidentifyitThebiologicalcharacters

7、andphysical&chemicalcharactersrevealedthethermo-tolerantstabilizerwassafeandstable,andcouldbestoredatroomtemperatureforthreemonths.Keywords:thermo-tolerantstabilizer；avianinfectiousbronchitisvimsattenuatedstrain(Hn);livingvaccine雞傳染性支,管炎凍干活疫苗是我國(guó)目前使用量較大的禽用疫苗。其產(chǎn)品要求在-151保存和運(yùn)輸，就我國(guó)目前基層縣、鄉(xiāng)、村的防疫條件而言，實(shí)際

8、上很難完全達(dá)到此條件。凍F活疫苗在溫差比較大的環(huán)境下運(yùn)輸、保存和使用往往造成病毒失活，免疫效力降低。而同類進(jìn)口產(chǎn)品均已實(shí)現(xiàn)在281保存，有效期達(dá)24個(gè)月，因此迫切需要研究一種新型的耐熱凍干保護(hù)劑，提高國(guó)產(chǎn)常規(guī)疫苗的耐熱性能。本研究以雞傳染性支氣管炎病毒Ek株為模型，進(jìn)行了比較試驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。1材料雞傳染性支氣管炎病毒Ha株、檢驗(yàn)用強(qiáng)毒M41株、中和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)毒為MN株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；7、14和21日齡，雞，10日齡SPF胚購(gòu)于北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；常規(guī)的雞傳染性支氣管炎Ha株活疫苗3批，購(gòu)于北京市獸醫(yī)生物藥品廠（批號(hào)為1999-107-4.1999-107-5.1999-10

9、7-6）；進(jìn)口雞傳染性支氣管炎凍干活疫苗為荷蘭英特威公司生產(chǎn)（批號(hào)為03-1999.43）；雞傳染性支，管炎病毒陽(yáng)性血清購(gòu)口中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。無(wú)萌檢驗(yàn)用硫乙酬酸鹽培養(yǎng)基（T.G）、酪豚瓊脂（G.A）和葡菊糖蛋白豚湯（G.P）購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基室。支原體檢驗(yàn)用Frey氏培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室制備°儀器設(shè)備為凍干機(jī)（Edwards公司，Lyoflex2.0）.水分測(cè)定儀（METTLERTOLEDO）、76-1型高頻電火花真空度測(cè)定儀。2方法2.1制苗用毒液的制備按中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程（以下簡(jiǎn)稱規(guī)程方法進(jìn)行）。2.2耐熱凍干保護(hù)劑篩選和凍干曲線優(yōu)化在不同保護(hù)劑基質(zhì)與病毒相

10、容性研究的基礎(chǔ)上，采用3種不同配方耐熱保護(hù)劑（WXS、AZW.BZW）和2種凍干曲線分別凍干，凍干后再進(jìn)行耐老化試驗(yàn)和物理性狀與水分含拈測(cè)定，篩選出最佳保護(hù)劑配方和凍干曲線。按照篩選出的最佳保護(hù)劑配方和優(yōu)化的凍干曲線試生產(chǎn)3批雞傳染性支氣管炎（HQ耐熱活疫苗，按規(guī)程進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、剩余水分和真空度等常規(guī)項(xiàng)目檢驗(yàn)。凍干曲線1：產(chǎn)品-5P進(jìn)箱,-40%：維持4h,產(chǎn)品由-40P升至-10%：維持10h,板層溫度提高到28P,全程24h。凍F曲線2：產(chǎn)品CH5K進(jìn)箱，以每分鐘1%：的速度降至-4（）P或者以下，維持4h,板層溫度控制在-10X2

11、,維持1416h,以每2h升溫10忙,板層溫度在25專維持6h出箱，全程30-32h0耐老化試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的3批疫苗，毒批隨機(jī)抽取疫苗1（）瓶，其中5瓶測(cè)疫苗效價(jià)，另外5瓶置37%：保存10d,按規(guī)程要求進(jìn)行病毒含量測(cè)定，確定疫苗的熱穩(wěn)定性。同時(shí)將3批常規(guī)雞傳染性支氣管炎活疫苗（H52株）及1批進(jìn)口疫苗作為對(duì)照。2.3 保存期試驗(yàn)對(duì)實(shí)臉室制備的3批疫苗置28I分別保存6、12、18、24個(gè)月，然后按規(guī)程要求進(jìn)行病毒含量測(cè)定，確定其穩(wěn)定性。2.4 免疫效力檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的3批疫侑在28P保存24個(gè)月后免疫SPF雞，每批疫苗均滴鼻法免疫21日齡的SPF雛雞10只，每只雞1個(gè)使用劑量。在免疫14

12、d后采血并分離血清，按規(guī)程”:要求測(cè)定血清的中和抗體效價(jià)。2.5 免疫持續(xù)期試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的3批雞傳染性支汽管炎（H慝株）耐熱活疫苗和常規(guī)國(guó)產(chǎn)H52疫苗（批號(hào)為1999-107-5）分別免疫21日齡SPF雞6個(gè)月后采血，分離血清。按規(guī)程要求測(cè)定血清的中和抗體效價(jià)。2.7特異性試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的3批疫苗，每批分別抽取5瓶.用生理鹽水稀釋至0.1只份/0.1mL,與等成抗雞傳染性支氣管炎特異性血清混合，在251作用lh,分別于尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10個(gè)，每胚（）.2niLo耐熱保護(hù)劑的生物學(xué)和理化特性測(cè)定將耐熱保護(hù)劑WXS在25P下保存30、60、90d,測(cè)其氨基氮的含量、pH值，及其

13、凍干活疫苗在凍干前、后疫苗病毒滴度的變化和耐熱性能。2.8 田間試驗(yàn)選擇吉林、廣東、夭津等3個(gè)省份不同雞場(chǎng)3.7萬(wàn)只雞，用本實(shí)驗(yàn)室制備的雞傳染性支7管炎耐熱活疫苗按瓶簽要求稀釋，進(jìn)行飲水免疫，并進(jìn)行臨床追蹤觀察。3結(jié)果耐熱凍干保護(hù)劑的篩選和凍干曲殘優(yōu)化結(jié)果雞傳染性支氣管炎（HQ毒株采用WXS配方耐熱保護(hù)劑與優(yōu)化的凍干曲線2,預(yù)凍效果最好，凍干后外觀不結(jié)晶，37%：保存10d也不萎縮，符合生物制品物理性狀的要求。其它2種配方凍干后外觀已經(jīng)不合格，故未進(jìn)行病毒含址的測(cè)定。將外觀合格的產(chǎn)品進(jìn)一步進(jìn)行耐老化試驗(yàn)，用WXS配方制備的疫苗病毒滴度下降較小,表明其耐熱性能更佳，具體見表lo表1耐熱凍干保護(hù)劑

14、的篩選和凍干曲線優(yōu)化結(jié)果>±：表榆狷保護(hù)刑種類凍干曲城1流干曲線2潦干后37P10d凍干后37110d效力外現(xiàn)效力外觀效力（EID、/只）外觀效力（EIDJ只）外觀WXS有少量結(jié)晶表面有片狀物.部分要爆10”未見堵肝1O5*不要煽BZW.J11/2見結(jié)冊(cè)表面下凹.大部分萎縮1儼上1/3結(jié)晶表而平坦10”大部分羲縮AZW上1/3結(jié)品表面卜凹大部分要縮IO1,上1/3結(jié)品表面下凹泌、大邠分英縮芥慵牛奶.上1/3結(jié)晶嚴(yán)重萋給10*'未見結(jié)晶1伊嚴(yán)柬萎娜3.1 疫苗常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果采用WXS配方耐熱保護(hù)劑和優(yōu)化的凍干曲線2,制備的3批雞傳染性支氣管炎病毒（H&株）耐熱活疫苗

15、（批號(hào)為9901.9902.9903）進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、剩余水分含量測(cè)定和真空度檢驗(yàn)等常規(guī)檢驗(yàn)，結(jié)果均合格，具體見表2。表23批疫苗的常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果批號(hào)物理無(wú)南支原體外源病安全剩余夏空效力檢驗(yàn)性狀檢臉檢驗(yàn)毒檢驗(yàn)檢驗(yàn)水分度（E1DJ只）9901微紅色疏無(wú)菌陰性陰性10/101.99%合格1O*1松海綢狀健活9902繳紅色成無(wú)的陰性陰性9/101.87%合格10*'松海綿狀健活*9903微紅色跋無(wú)菌陰性陰性9/101.75%合格10*7松海綿狀他活、注：A24h內(nèi)死亡3.2 耐老化試臉結(jié)果實(shí)驗(yàn)室制備的3批耐熱凍干活疫苗和荷蘭的英特威公司與國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品同時(shí)進(jìn)行耐

16、老化試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室制備的3批疫苗凍干后笛羽份病毒含量達(dá)EIDso.37r保存10d,其疫苗每羽份病毒含量下降了0.6F.8個(gè)滴度。國(guó)內(nèi)同類常規(guī)牛奶、脫脂牛奶保護(hù)劑的疫苗則分別下降了2.42.6個(gè)滴度。國(guó)外進(jìn)口1批疫苗下降1.2個(gè)滴度（見表3）。3.4保存期試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)室制備的3批耐熱活疫苗于2TP保存«33批疫苗耐老化試驗(yàn)培果EID./只批號(hào)疫苗毒價(jià)37r10d疫苗毒價(jià)990110*'10°990210°10,99903i時(shí)V英特威10°10”1999-107-410°10*1999-107-510°10”1999-107-61

17、0*'10°24個(gè)月后，每羽份病毒含噠僅下降0.&W.8個(gè)滴度,每羽份病毒含量仍達(dá)到10'10"EID,）,符合規(guī)程要求（每羽份病毒NIO"EIDso）。國(guó)內(nèi)常規(guī)疫苗在28K保存6個(gè)月就已經(jīng)不合格。國(guó)外同類產(chǎn)品保存24個(gè)月后每羽份病毒含量也僅下降0.6個(gè)滴度（見表4）。表43批疫苗保存期結(jié)果EID/只28P（月）注：未佐測(cè)批號(hào)原始效價(jià)6121824990110*'10"104'10°10°990210"104,104'10°10*'990310。10*710&

18、#176;10°英特威10*7葉1儼10*'1999-107-410°101'101*.1999-107-510。10*'爐1999-107-6to*11尹1O1'.*3.5免疫效力檢驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)室制備的3批雞傳染性支氣管炎Hsz耐熱活疫苗經(jīng)28P保存24個(gè)月后，經(jīng)血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)仍達(dá)到1：16,均達(dá)到規(guī)程要求（>1：8）的質(zhì)場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)免疫雞群仍起到很好的保護(hù)作用（見表5）。表53批疫苗的效力檢驗(yàn)結(jié)果.28r24個(gè)SPF格綸唆免檢利仙、途捋采時(shí)間.血清中和抗體效價(jià)供'月（EID»/H）（只）9901Wli1021IO

19、*5EIIX/只的免疫后1:16-3299021()*'|>21梅森液滴昴免疫14d1：16990310*'10211：162.6 免疫持續(xù)期試驗(yàn)結(jié)果用實(shí)驗(yàn)室制備的3批用傳染性支y管炎耐熱活疫苗免疫雞,6個(gè)月后采集血清其中和抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果均N1：16,與常規(guī)對(duì)照疫苗相一致。具體結(jié)果見表6。哀63批疫苗血清中和抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果批號(hào)原始牧價(jià)（EIIX/JI）采血H齡dliil中和SPFK(個(gè))(ml.)中相抗體結(jié)果99011(尸2(K)湘峰和1：1612«».299021OV稀#分別，120.2>1：169903i(r100Eld中fB12().2

20、耕毒對(duì)照66/6死r.正常對(duì)照66/6ft!活田間試驗(yàn)檢測(cè)姑果3批疫苗在3個(gè)省份田間試驗(yàn)中臨床觀察和病例剖檢結(jié)果表明雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗對(duì)免疫雞群安全、有效、質(zhì)里可控。具體結(jié)果見表7。表73批疫苗田間試驗(yàn)結(jié)果批號(hào)接沖途徑數(shù)M效梨疑察吉林990130飲水2、只好排免校后35.Ed.分別利校廣東990235挾水0.9)1只5只妗.嗾頭、氣管、支丁管無(wú)水天津990330伏水<».«萬(wàn)只腫、出血.玷液地務(wù)等病變."生產(chǎn)網(wǎng)期未見界常。it明：將傳染性支'（管炎耐熙活授尚*免疫相安全.有效3.8特異性試臉結(jié)果將實(shí)驗(yàn)室制備3批雞傳染性支氣管炎耐熱活疫苗稀釋后與等破陽(yáng)性血清中和，再接種SPF雞胚24h后均存活，證明特異性檢噩合格（見表8）。3.9 耐熱保護(hù)劑生物學(xué)和理化特性的測(cè)定結(jié)果將篩選好的WXS配方在25P保存30.60和90d,其理化特性未發(fā)生改變,再與雞傳染性支氣管炎病毒制備的耐熱疫苗比較其耐熱性能未發(fā)生明顯改變，安全性能沒(méi)有改變，均符合規(guī)定，其體結(jié)果見表9。表83批疫苗的特異性檢測(cè)皓果ii：A24h內(nèi)此亡批號(hào)凍后穌始效價(jià)（EI1WH）中和剖檢"活率99011儼用生埋找水稀仲至成察144h./$9/10*99020.1羽mL.M肝航兒未北失10/10990