耳針對血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的干預研究

1、耳針對血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的干預研究 呂杭州,王春慶,呂明莊,胡文清作者單位：054000 河北省邢臺市，邢臺礦業(yè)集團總醫(yī)院康復科(呂杭州);貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院針灸科(王春慶、呂明莊);河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院康復科(胡文清)【摘要】目的 觀察耳針對血管性癡呆(VD)大鼠記憶力、海馬神經(jīng)元細胞凋亡及凋亡蛋白酶caspase3 mRNA表達的影響，探討耳針治療VD的可能機制。方法 采用4血管阻斷方法制備VD大鼠模型,針刺腦、腎耳穴后,morris迷宮檢測大鼠學習記憶能力改善情況、原位末端標記法觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)、原位分子雜交觀察促凋亡蛋白酶caspase3 mRNA表達的變

2、化。結果 治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)明顯減少(P0.01)，caspase3 mRNA表達降低(P0.01),and the expression of caspase3 mRNA was reduced too,which was negatively correlated with learning and memory abilities in the rats. Conclusion Auricular acupuncture can improve the disorder of learning and memory abilities in rats with VD,an

3、d its action mechanism may be that acupuncture could downregulate the expression of caspase3 mRNA, inhibit the neuronal apoptosis, protect the hippocampus neuron after cerebral ischemia.【Key words】 auricular acupuncture; dementia,vascular; cell apoptosis; acupuncture therapy; hippocampus血管性癡呆(vascul

4、ar dementia,VD)是指腦血管障礙所致，以癡呆為主要臨床表現(xiàn)的疾病。本實驗選用改良的4血管阻斷(4vesselocclusion,4VO)制備VD大鼠模型,觀察耳針對海馬神經(jīng)元細胞凋亡及促凋亡蛋白酶表達的影響，探討耳針治療VD的可能機制。1 材料與方法1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠32只，雌雄各半，雙耳無缺損，34月齡，體重200250 g,由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物房室溫1518，濕度70%左右，相同光照條件喂養(yǎng)，自由攝取大鼠標準飼料，飲用干凈自來水。適應性喂養(yǎng)1周后開始試驗。1.2 試劑與儀器 morris迷宮(中國中醫(yī)研究院)細胞凋亡檢測試劑盒、caspase3

5、 mRNA原位雜交檢測試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)。1.3 方法VO方法制作擬血管性癡呆動物模型。用10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，背側正中切口暴露第一頸椎橫突側翼小孔，電凝雙側椎動脈，造成永久性閉塞。然后頸前部切口找到雙側頸總動脈，穿線備用，在大鼠清醒狀態(tài)下用微動脈夾可逆性夾閉雙側頸總動脈5 min，共3次，每次間隔1 h，然后縫合，常規(guī)飼養(yǎng)。模型成功的標志：術中四血管完全離斷后1 min可見大鼠翻正反射消失，大鼠虹膜在缺血后幾秒中變蒼白色，再灌注后以上情況恢復正常。術后morris迷宮檢測發(fā)現(xiàn)大鼠學習記憶能力明顯下降。術后10 d病理切片可見明顯缺血

6、缺氧和海馬神經(jīng)元細胞損傷表現(xiàn)：腦組織明顯水腫;散在腦梗死灶;典型的噬細胞現(xiàn)象;神經(jīng)元細胞核固縮、核仁消失等。3 mRNA檢測:采用原位雜交間接法，石蠟切片脫蠟至水;滴加30%H2O2，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗滌;滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37消化30 min 以暴露mRNA片段;原位雜交用PBS 洗滌;每張切片加預雜交液20 l置入濕盒，恒溫箱42,4 h，不洗;每張切片加雜交液20 l置入濕盒，恒溫箱42 過夜(16 h);2SSC 37水溫5 min2次。滴加封閉液37，30 min;甩去多余液體，不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛37，60 min;原位雜交用PBS 洗

7、滌;滴加SABC 37，20 min;原位雜交用PBS 洗滌; 滴加生物素化過氧化物酶37，20 min;原位雜交用PBS 洗滌;DAB顯色10 min;充分水洗，蘇木素復染、脫水、透明、封片。1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以s表示，各組間比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVE )和q檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 學習記憶能力測試結果 模型組找到平臺時間與術前及對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),耳針治療組找到平臺時間與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。見表1。2.2 3組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)比較 以陽性細胞數(shù)表示缺血神經(jīng)

8、元損傷程度。模型組TUNEL標記陽性細胞數(shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);耳針治療組TUNEL標記陽性細胞數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。見表2。2.3 3組caspase3 mRNA表達陽性細胞數(shù)比較 caspase3 mRNA表達陽性細胞計數(shù)，模型組caspase3原位雜交細胞陽性數(shù)與對照組比較明顯增加(P0.01);耳針治療組caspase3原位雜交陽性細胞數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。見表2。表1 3組大鼠morris迷宮學習記憶成績比較表2 3組神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)、caspase3 mRNA表達注：與對照組比較，*P0.05，#P0.01;與模

9、型組比較，P0.013 討論內(nèi)經(jīng)云“耳者，宗脈之所聚也。”耳與經(jīng)絡系統(tǒng)及全身臟腑器官有密切聯(lián)系，針刺耳穴可治療多種疾病。耳穴腎可益腎填精、壯骨補髓,耳穴腦可以健腦益智，通腦絡。本實驗選用耳穴腎、腦治療VD大鼠，行為學測試結果顯示，針刺耳穴腎、腦明顯改善VD大鼠學習記憶障礙。Macmanns等1首先報道大鼠腦缺血后海馬CAI區(qū)、紋狀體出現(xiàn)DNA梯狀片斷，并通過終末標志技術定量發(fā)現(xiàn)DNA損傷程度與缺血程度成正比關系。證明全腦缺血后細胞死亡機制既有壞死也有凋亡。腦缺血可引起凋亡，其凋亡細胞多少、發(fā)生部位與缺血時間、程度及神經(jīng)元敏感性有關2。細胞凋亡是受基因調(diào)控的程序性死亡，caspase家族是一大類

10、凋亡調(diào)節(jié)基因,與線蟲的死亡基因CED3同源,是哺乳動物細胞凋亡的啟動和執(zhí)行者3。其中caspase3與CED3同源性最高，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用。在蛋白酶級聯(lián)切割過程中，caspase3處于核心位置,不同的蛋白酶分別切割caspase3酶原,從而激活caspase3;活化的caspase3又進一步切割不同的底物,導致蛋白酶級聯(lián)切割放大,最終使細胞走向死亡4，5。抑制 caspase3激活表達，就可以減輕由它介導的缺血性神經(jīng)元損害。本實驗結果顯示，VD模型大鼠大腦切片經(jīng)檢測，發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)出現(xiàn)大量神經(jīng)元細胞凋亡，同時caspase3 mRNA高表達。證實反復的缺血再灌注和長期

11、的低灌注狀態(tài)可導致功能神經(jīng)元發(fā)生繼發(fā)性損害細胞凋亡，海馬是敏感易受損區(qū)，智能損害是神經(jīng)元損害的結果。腦缺血發(fā)生后，caspase3在凋亡的事件中耳針治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)原細胞凋亡數(shù)明顯減少，caspase3 mRNA表達下調(diào)，學習記憶障礙明顯改善，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義。提示耳針改善VD大鼠的學習記憶能力障礙的可能機制是，耳針抑制caspase3 mRNA的表達，中斷由蛋白酶介導的細胞凋亡過程，減少神經(jīng)元細胞凋亡，保護缺血受損的神經(jīng)元細胞，最終起到治療VD的作用。【參考文獻】1 Macmanus JP,Hill IE,Huang ZG,et al.DNA damage consiste