調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能有效防治原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)

1、調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能有效防治原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)？1、項(xiàng)目研究意義復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是一種常見(jiàn)的病理性妊娠，在育齡婦女中的發(fā)病率約為1%2%。其病因除與遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染因素等有關(guān)外，仍有60%70%的患者病因不明，臨床上稱(chēng)之為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）1,2。該病病因不明，療效不佳，常導(dǎo)致難治性不孕。由于多次妊娠和流產(chǎn)，給URSA患者身心帶來(lái)極大痛苦，嚴(yán)重影響了育齡婦女的生殖健康。因此，探索其病因，尋找合適、有效的治療方法，已成為目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外的研究公認(rèn)，URSA主要與母胎免疫耐

2、受機(jī)制紊亂有關(guān)3-5， 表現(xiàn)為CD4+/CD8+T細(xì)胞比值異常、Th1/Th2平衡失調(diào)、NK細(xì)胞亞群失調(diào)等。但是，調(diào)控這些免疫細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)是什么？這仍是一個(gè)不解之謎。新近研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell, Tr）是維持機(jī)體免疫耐受的主要因素。Tr是不同于Th1和Th2的具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，其中研究得較為清楚的亞型為CD4+CD25+Tr。CD4+CD25+Tr是由Sakaguchi等于1995年首次發(fā)現(xiàn)的，其特征為表達(dá)CD25（IL-2受體鏈）這一膜分子。CD4+CD25+T細(xì)胞在不同種屬呈進(jìn)化保守性，對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK

3、T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等免疫細(xì)胞均具有調(diào)控作用6-8。它不僅在防止自身免疫耐受中起重要作用，而且還參與調(diào)控腫瘤免疫和移植耐受。目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)r的研究才剛剛起步，許多問(wèn)題還懸而未決。探索Tr在母胎免疫耐受中的作用及其機(jī)制、Tr與URSA的關(guān)系，并探尋其用于治療URSA的可行性，對(duì)于URSA發(fā)病機(jī)制和防治措施的研究具有重要意義。本課題擬從臨床和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面，通過(guò)整體、離體、細(xì)胞及分子等水平，全面檢測(cè)URSA患者母胎界面和外周血CD4+CD25+Tr的表達(dá)和功能，研究該細(xì)胞調(diào)控母胎免疫耐受的具體機(jī)制，以及探索通過(guò)各種手段擴(kuò)增或誘導(dǎo)該細(xì)胞的表達(dá)能否治療URSA。本課題的實(shí)施，不僅對(duì)豐富妊娠免疫耐受學(xué)說(shuō)

4、有著重要的理論意義，并且對(duì)提高育齡婦女的生殖健康、努力構(gòu)建社會(huì)主義和諧社會(huì)，也有著不可低估的現(xiàn)實(shí)意義。2、項(xiàng)目研究目標(biāo)及與申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系；研究目標(biāo)1. 明確Tr在母胎免疫耐受中的作用特點(diǎn)。2. 明確Tr /Te平衡對(duì)妊娠取向的影響。3. 探討擴(kuò)增、誘導(dǎo)CD4+CD25+Tr的條件。4. 探索通過(guò)調(diào)控Tr來(lái)防治URSA的可行性。與申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系本課題組長(zhǎng)期致力于免疫相關(guān)性妊娠疾病的研究，從血管舒縮因子到免疫調(diào)節(jié)，從整體器官細(xì)胞、分子水平逐步深入。尤其近年來(lái)，作為學(xué)科研究方向之一，對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）的病因、發(fā)病機(jī)制、治療進(jìn)行了有意義的探討。本課題組最近的研

5、究發(fā)現(xiàn)：正常妊娠孕婦外周血CD4+CD25+Tr比率顯著增加，并且在妊娠過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化（詳見(jiàn)“工作基礎(chǔ)”）。本項(xiàng)目擬在此基礎(chǔ)上，通過(guò)探討CD4+CD25+Tr與URSA的關(guān)系以及在治療URSA中的作用，了解Tr在妊娠中的作用，豐富妊娠免疫耐受理論，并為免疫相關(guān)性病理妊娠的防治提供新的策略。因此，本項(xiàng)目研究是本課題組長(zhǎng)期研究目標(biāo)之一和重要組成部分。3、項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排研究?jī)?nèi)容（一）臨床研究1. 分別檢測(cè)病例組（URSA患者）和對(duì)照組（正常妊娠人工流產(chǎn)者）外周血和蛻膜CD4+CD25+Tr的分布特點(diǎn)，以了解CD4+CD25+Tr數(shù)量與妊娠取向的相關(guān)性。2. 檢測(cè)上述被研究者外周血

6、和蛻膜中CD4+CD25+Tr抑制自身T細(xì)胞增殖的效率，以了解CD4+CD25+Tr功能與妊娠取向的相關(guān)性。3. 檢測(cè)上述被研究者母胎界面APC細(xì)胞中共刺激分子的表達(dá)水平，以了解CD4+ CD25+Tr與APC功能的相關(guān)性。4. 研究上述被研究者母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2型（IL-4、IL-10、TGF-）細(xì)胞因子的表達(dá)水平，以了解CD4+CD25+Tr與Th1/ Th2平衡的相關(guān)性。（二）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1. 檢測(cè)不同劑量的TGF-、IL-10等細(xì)胞因子誘導(dǎo)CD4+CD25+Tr體外擴(kuò)增的效果，以明確CD4+CD25+Tr大量擴(kuò)增的最佳誘導(dǎo)方案。2. 檢測(cè)Foxp3基

7、因轉(zhuǎn)染后，CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr轉(zhuǎn)化的效率。3. 檢測(cè)過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+CD25+Tr后，自然流產(chǎn)模型小鼠胚胎吸收率的變化，以確定CD4+CD25+Tr對(duì)妊娠取向的影響。4. 檢測(cè)過(guò)繼轉(zhuǎn)輸后CD4+CD25+Tr在小鼠全身的定位，以確定其在妊娠過(guò)程中的分布特點(diǎn)。5. 檢測(cè)過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+CD25+Tr后，自然流產(chǎn)模型小鼠APC細(xì)胞中共刺激分子的表達(dá)水平變化，以了解CD4+ CD25+Tr對(duì)APC功能的影響。6. 研究過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+CD25+Tr后，自然流產(chǎn)模型小鼠母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2型（IL-4、IL-10、TGF-）細(xì)胞因子的表達(dá)水

8、平，以了解CD4+CD25+Tr對(duì) Th1/ Th2平衡的影響。研究方法（一）臨床研究1. 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為URSA組和正常妊娠人工流產(chǎn)組（正常妊娠要求人工流產(chǎn)病例）。免疫不耐受性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：流產(chǎn)病人排除夫妻雙方和胚胎染色體異常，子宮解剖結(jié)構(gòu)異常，內(nèi)分泌異常，生殖道感染，自身免疫性疾?。沽字贵w陽(yáng)性、抗核抗體陽(yáng)性）。2. 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)CD4+CD25+Tr的比率。3. 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）檢測(cè)CD4+CD25+Tr抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力。4. 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)母胎界面APC細(xì)胞CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)。5. ELISA檢測(cè)母胎界面Th1型（IL-

9、2、IL-12、IFN-）、Th2 型（IL-4、IL-10、TGF-）細(xì)胞因子表達(dá)水平。（二）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1. CD4+CD25+Tr體外大量擴(kuò)增：不同劑量的TGF-、IL-10等細(xì)胞因子與CD4+CD25+Tr共同孵育。2. CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr轉(zhuǎn)化：構(gòu)建Foxp3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，篩選、擴(kuò)增陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)染CD4+CD25-T。3. 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為自然流產(chǎn)治療組（自然流產(chǎn)動(dòng)物過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+CD25+Tr），自然流產(chǎn)對(duì)照組。4. 肉眼計(jì)數(shù)吸收胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。按下式計(jì)算胚胎吸收率(R)：R = Re /Re + F。Re為吸收胚胎數(shù)，F(xiàn)

10、為存活胚胎數(shù)。5. 單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT）檢測(cè)CD4+CD25+Tr在受體體內(nèi)的歸巢和分布。6. 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)母胎界面APC細(xì)胞CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)。7. ELISA檢測(cè)母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2 型（IL-4、IL-10、TGF-）細(xì)胞因子表達(dá)水平。技術(shù)路線（一）臨床研究URSA組和正常妊娠人工流產(chǎn)組分離外周血、蛻膜淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Tr比率（FCM）CD4+CD25+Tr抑制能力（MLR）Th1、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平（ELISA）分離胎盤(pán)、蛻膜組織分離胎盤(pán)、蛻膜APC細(xì)胞CD80、CD86表達(dá)水平（FC

11、M）（二）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr轉(zhuǎn)化自然流產(chǎn)動(dòng)物模型體外大量擴(kuò)增CD4+CD25+Tr過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+CD25+Tr分離胎盤(pán)、蛻膜組織分離胎盤(pán)、蛻膜APC細(xì)胞CD4+CD25+Tr歸巢（SPECT）胚胎吸收率Th1、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平（ELISA）CD80、CD86表達(dá)水平（FCM）進(jìn)度安排2006.012006.03收集臨床標(biāo)本；預(yù)定試劑、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備；進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。2006.042006.10檢測(cè)臨床標(biāo)本中CD4+CD25+Tr的分布特點(diǎn)、功能變化，確定其與妊娠取向的關(guān)系和對(duì)共刺激分子、細(xì)胞因子表達(dá)水平的相關(guān)性。2006.112007.03分離、

12、純化、體外擴(kuò)增CD4+CD25+Tr；建立動(dòng)物模型，過(guò)繼轉(zhuǎn)輸CD4+CD25+Tr。2007.042007.10檢測(cè)動(dòng)物模型中CD4+CD25+Tr相關(guān)分子的表達(dá)水平，確定CD4+CD25+Tr對(duì)妊娠取向及共刺激分子、細(xì)胞因子表達(dá)的影響。2007.112007.12結(jié)題、成果鑒定，申報(bào)新課題或獎(jiǎng)項(xiàng)。4、項(xiàng)目創(chuàng)新之處現(xiàn)有的研究已發(fā)現(xiàn)，URSA主要與母胎免疫耐受機(jī)制紊亂有關(guān)，表現(xiàn)為：CD4+/CD8+T細(xì)胞比值異常、Th1/Th2平衡失調(diào)、NK細(xì)胞亞群失調(diào)等。但是，調(diào)控這些免疫細(xì)胞的中心環(huán)節(jié)是什么？這仍是一個(gè)不解之謎。最近在蒙特利爾召開(kāi)的免疫學(xué)國(guó)際會(huì)議上，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在調(diào)控免疫應(yīng)答方面的作用引起了

13、與會(huì)者極大興趣。所謂調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Tr)，是一類(lèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用、維持自身免疫耐受的T細(xì)胞9。其主要通過(guò)細(xì)胞間接觸抑制分泌細(xì)胞因子IL-10、TGF-等方式下調(diào)針對(duì)外來(lái)或自身抗原的免疫應(yīng)答以維持免疫耐受。目前認(rèn)為，CD4+CD25+Tr在維持外周免疫耐受中起關(guān)鍵作用，全面監(jiān)控免疫系統(tǒng)并維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。臨床觀察證實(shí)：在早、中期妊娠母體外周血和蛻膜組織中，CD4+CD25+Tr比率明顯增加10；而自發(fā)性流產(chǎn)患者的蛻膜CD4+CD25+Tr比率則明顯降低11。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺乏CD4+CD25+Tr可致小鼠妊娠失敗12。這強(qiáng)烈提示CD4+CD25+Tr介導(dǎo)母體

14、對(duì)胎兒的免疫耐受。但是關(guān)于CD4+CD25+Tr在母胎免疫耐受中的具體作用機(jī)制和作用環(huán)節(jié)，目前研究甚少。根據(jù)現(xiàn)有的免疫學(xué)知識(shí)，我們假設(shè)：胚胎抗原在激活母體效應(yīng)性T細(xì)胞（Te）參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的同時(shí)，還刺激母體Tr分化增殖，并通過(guò)細(xì)胞細(xì)胞接觸方式或分泌細(xì)胞因子抑制Te的功能，進(jìn)而導(dǎo)致母胎免疫耐受；一旦Tr分化、發(fā)育障礙或功能減弱，或者Te生成過(guò)多，或逃逸Tr的監(jiān)控則可出現(xiàn)流產(chǎn)等病理性妊娠。簡(jiǎn)言之，調(diào)節(jié)性與效應(yīng)性T細(xì)胞之平衡狀況是維持正常妊娠的關(guān)鍵。本課題將CD4+CD25+Tr引入妊娠免疫研究，從調(diào)節(jié)性T細(xì)胞這一全新的角度來(lái)研究妊娠免疫耐受的機(jī)制。并提出用“Tr/Te平衡”學(xué)說(shuō)來(lái)詮釋母胎免疫耐受

15、之機(jī)制。本課題還以糾正Tr/Te失衡為切入點(diǎn)，嘗試通過(guò)調(diào)控Tr來(lái)糾正URSA，以探尋防治此種流產(chǎn)的新方法。從“Tr/Te平衡”角度來(lái)詮釋母胎免疫耐受理論，并以此為突破口來(lái)防治URSA，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)類(lèi)似報(bào)道。該假說(shuō)一旦被證實(shí)，將極大地豐富妊娠免疫耐受理論，并為此類(lèi)流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等一類(lèi)免疫相關(guān)性病理妊娠的防治提供新的策略，從而保證了課題的先進(jìn)性。5、工作基礎(chǔ)與工作條件1、工作基礎(chǔ)本教研室為浙江省、溫州醫(yī)學(xué)院兩級(jí)重點(diǎn)學(xué)科教研室。課題負(fù)責(zé)人黃引平師從同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)婦產(chǎn)科內(nèi)分泌專(zhuān)家吳熙瑞和馬庭元教授，自80年代末開(kāi)始，致力于高危妊娠發(fā)病機(jī)制的研究。先后承擔(dān)或參加了多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金課題、國(guó)家“七五

16、”、“八五”等科技攻關(guān)項(xiàng)目；1998年引入溫州醫(yī)學(xué)院后又相繼獲得兩項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金，具有豐富的科研經(jīng)驗(yàn)。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)：與非孕婦女比較，正常妊娠孕婦外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tr的比率顯著增高（見(jiàn)圖1）。比較早孕、中孕、晚孕婦女的外周血淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中CD4+CD25+Tr的比率隨妊娠進(jìn)展呈動(dòng)態(tài)變化（見(jiàn)圖2）。本課題擬在此基礎(chǔ)上研究CD4+CD25+Tr與母胎免疫耐受的關(guān)系，并探索通過(guò)調(diào)控CD4+CD25+Tr來(lái)防治URSA的可行性。CD4CD25圖1 妊娠婦女與非孕婦女外周血CD4+CD25+Tr比率的比較妊娠婦女非孕婦女圖2 妊娠各期外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25

17、+Tr的比率2、工作條件本學(xué)科實(shí)驗(yàn)室已具備完成本實(shí)驗(yàn)的基本設(shè)備，如細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器。所在醫(yī)院有專(zhuān)門(mén)從事基礎(chǔ)研究的醫(yī)科所，現(xiàn)已有設(shè)備配置超千萬(wàn)元，基本滿足分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等方面研究的需要；擁有的大型儀器有：倒置相差顯微鏡、CO2自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、立體手術(shù)顯微鏡、酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、高速離心機(jī)、流式細(xì)胞儀、PCR儀、DNA合成儀、核酸測(cè)序儀、基因相差顯示系統(tǒng)、毛細(xì)管電泳、多種類(lèi)型的電泳系統(tǒng)和成像系統(tǒng)等，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)需要。所在醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心可提供清潔級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件。所需試劑材料均可從國(guó)內(nèi)外公司購(gòu)得。本實(shí)驗(yàn)室與楊煥明教授領(lǐng)導(dǎo)的華大基因

18、公司和葉篤筠教授所在衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室有著很好的合作關(guān)系。因此，已具備完成本課題所需條件。6、預(yù)期研究結(jié)果及其利用研究結(jié)果的計(jì)劃和今后發(fā)展的思路本課題將為母胎免疫耐受理論提供新的學(xué)說(shuō)，并為防治原因不明性流產(chǎn)等一類(lèi)免疫相關(guān)性病理妊娠提供新思路。本課題的完成，有望使調(diào)控Tr成為防治母胎免疫耐受異常的有效手段，為攻克復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和難治性不孕這些醫(yī)學(xué)難題提供新的途徑，給臨床上此類(lèi)不孕患者帶來(lái)福音。研究成果預(yù)計(jì)可在國(guó)內(nèi)外雜志上發(fā)表較高水平的學(xué)術(shù)論文46篇，并申報(bào)相關(guān)成果獎(jiǎng)。本項(xiàng)目還將協(xié)助培養(yǎng)碩士生34名，博士生12名。7、參考文獻(xiàn)1. Whitcomb DJ. Abortion surveill

19、ance. AWHONN Lifeline, 2004, 8(2):112-114.2. 林其德。URSA的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展。中華婦產(chǎn)科雜志，2003，38（8）：481-483。3. Aluvihare VR, Kallikourdis M, Betz AG. Tolerance, suppression and the fetal allograft. J Mol Med, 2005, 83(2):88-96.4. Carp H. Cytokines in recurrent miscarriage. Lupus, 2004, 13(9):630-634.5. Chaouat G, Le

20、dee-Bataille N, Dubanchet S, et al. Reproductive immunology 2003: reassessing the Th1/Th2 paradigm? Immunol Lett, 2004, 92(3):207-214.6. Fallarino F, Grohmann U, Hwang KW, et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nat Immunol, 2003, 4(12):1206-1212.7. Trzonkowski P, Szmit E,

21、Mysliwska J, et al. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction. Clin Immunol, 2004, 112(3):258-267.8. Earle KE, Tang Q, Zhou X, et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin Immunol, 2005, 115(1