龍葵堿對(duì)雄性小鼠遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究

1、龍葵堿對(duì)雄性小鼠遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究龍葵堿對(duì)雄性小鼠遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究季宇彬1,2王斌1,2 郎朗1,2（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究發(fā)展中心 藥物研究所 博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150076；2.國(guó)家教育部 抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）摘要摘要 目的目的 探討龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞、精子的毒性作用。方法方法 采用流式細(xì)胞儀分析龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的影響；采用微核試驗(yàn)技術(shù)觀察龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核變化的影響；采用精子畸形試驗(yàn)觀察雄性小鼠精子畸形率的變化。結(jié)果結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)到龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的結(jié)果表明，G0/G1期細(xì)胞比率隨劑量增

2、加而不斷升高,S 期和 G2/M 期比率均有下降。這表明細(xì)胞被阻滯在 G0/G1期，影響 DNA 的合成，進(jìn)而影響 G2/M 期，使進(jìn)入這一期細(xì)胞數(shù)減少,證明龍葵堿對(duì)骨髓細(xì)胞周期可產(chǎn)生明顯的干擾。微核發(fā)生率和精子畸形率隨劑量增高而逐漸增加。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,高中低劑量組與陰性對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)條件龍葵堿對(duì)雄性小鼠存在遺傳毒性影響。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞 龍葵堿；細(xì)胞周期；骨髓微核；精子畸形Study of solanin on Genotoxicity of male miceJi YuBin1,2,WangBin1,2,LangLang1,2(1. Postdoctor

3、al Research Station, Inistitute of Materia Medica, Life Science and Enviroment Science Research Center, HarBin Commerce University, HeiLongJiang HarBin 150076, china; 2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of National Education, HeiLongJiang HarBin 150076, china)Abstrac

4、t Objective:To explore the toxic effect of solanin on myeloid cell and spermatozoon in male mice.Methods: To analyze the effect of solanine on cell cycle of myeloid cell in male mice by flow cytometer(FCM) assay and to study the effect of solanin on myeloid cell and spermatozoon in male mice by micr

5、onucleus test of myeloid cell and sperm deformity test. Result: G0/G1 pcriod increase, S and G2/M pcriod decrease in solanine group. It indicates that solanin block myeloid cell in G0/G1 phasc to stop the DNA synthcsis and to reduce cell population of G2/M pcriod.Therefore, Solanin is proved to prod

6、uce conspicuous interference on myeloid cell. High-dosage groups medium-dosage groups and low-groups of Solanin all show statistical significance(P0.05) compared with antifertility-dosage groups in micronuclei assay of myeloid cell and sperm deformity test. Conclusion:The genetoxic influence of sola

7、nin on male mice is existed in such experiment condition.KeyWords Solanin; Cell cycle; myeloid cell; sperm deformity龍葵提取物含多種具有抗腫瘤作用有效藥理成分，抗腫瘤作用最主要成分為生物堿，龍葵堿又名茄堿，主要存在于茄科植物馬鈴薯的塊莖及龍葵的全草中。龍葵堿有抗腫瘤作用，對(duì)動(dòng)物腫瘤的抑制率極強(qiáng),有明顯的細(xì)胞毒作用1。同時(shí)龍葵堿也是一種致命毒素，對(duì)胃腸黏膜有較強(qiáng)的刺激作用，對(duì)中樞神經(jīng)有麻痹作用，人體吸收過(guò)量龍葵堿可引起頭痛,腹痛,嘔吐,腹瀉,瞳孔擴(kuò)大，心跳先快后慢，精神錯(cuò)亂,昏迷等

8、癥，但是龍葵堿并非立即致死，卻會(huì)慢慢累積在體內(nèi)。有報(bào)道龍葵堿有胚胎毒性可導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)，該類(lèi)生物堿明顯地?fù)p害胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育及分化,有極強(qiáng)的胚胎毒性。但是目前,對(duì)于龍葵堿在遺傳及生殖毒性方面的研究在國(guó)內(nèi)外均少見(jiàn)報(bào)道，必要進(jìn)行這方面的研究，為評(píng)價(jià)其安全性及保護(hù)人類(lèi)免受龍葵堿的毒性危害提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。本文通過(guò)對(duì)龍葵堿遺傳毒性的觀察來(lái)探討龍葵堿對(duì)哺乳動(dòng)物是否有遺傳毒性方面的影響。1 1 材料與方法材料與方法1.1 受試物 龍葵堿，純度為 98%，由黑龍江藥品檢驗(yàn)所提供。1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用昆明小白鼠,由哈爾濱腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞周期檢測(cè)試驗(yàn) 選用性成熟雄性小

9、鼠 60 只,體重 1825g,隨機(jī)分為 6 組每組 3 只，給藥和取材時(shí)間同微核試驗(yàn)。將小鼠處死后，取出雙側(cè)股骨，去肌肉，擦凈血污，剪開(kāi)兩端關(guān)節(jié)面，用注射器吸 3ml PBS 液沖出骨髓于試管中，滴管吹散，300 目篩網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min 離心洗滌 10min，棄去上清，將細(xì)胞重新懸浮于 PBS 中，鏡檢，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 1106 /ml。取 1ml 細(xì)胞懸液，迅速噴射到預(yù)冷的70乙醇中，混勻，4放置過(guò)夜。過(guò)夜后，離心去除乙醇，加PBS，1000r/min 離心洗滌 10min，2 次。棄上清后余下 0.5ml，加入 1mlPI 染液，37避光染色 30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光

10、波波長(zhǎng)為 488nm,發(fā)射光波波長(zhǎng)大于 630nm。每份樣品選取 10000 個(gè)細(xì)胞用 Multicycle 進(jìn)行自動(dòng)分析。1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理方法 研究數(shù)據(jù)采用 SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)。均采用方差分析，組與組間采用 LSD 方差分析。 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 將體重 2026g 的雄性小鼠 30 只隨機(jī)分為 5 組,每組 6 只,即陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺 40mg/kg)龍葵堿高劑量組 1/2LD50(21mg/kg)、中劑量組 1/4LD50(10.5mg/kg)和低劑量組 1/8LD50(7.25mg/kg)。各組都采用腹腔注射方法，龍葵堿給藥組共給藥

11、兩周。每周按體重調(diào)整一次劑量。停藥后 24h 處死。陽(yáng)性對(duì)照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺 40 mg/kg，采用 30 小時(shí)給藥法注射 2 天，于第 2 天注射后 6 小時(shí)用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開(kāi)腹腔，迅速用手術(shù)剪將其后肢股骨取下，剔去肌肉，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去兩端的骨骺，用帶針頭的 2ml 注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊使其均勻，以 1000rmin 速度離心 10min，棄去多余的上清液，留下約 0.5ml 與沉淀物混勻后，用滴管吸取并滴一滴在清潔的載玻片上，推片。將推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇溶液固定15min，取出晾干。用新鮮配制的

12、 Giemsa 工作液（Giemsa 儲(chǔ)備液 1 份加 pH6.8的磷酸緩沖液 9 份）染色 1015min，然后沖洗掉玻片上的染色液，風(fēng)干。于油鏡下每只小鼠計(jì)數(shù) 1000 個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE),觀察含有微核的 PCE 數(shù),并計(jì)算其微核率。 精子畸形試驗(yàn) 選用性成熟雄性小鼠 60 只,體重 1825g,隨機(jī)分為 5 組每組 6 只, 陽(yáng)性對(duì)照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺 40mg/kg，連續(xù)染毒 5 天，第 1214 天處死。除陽(yáng)性組外各組給藥劑量同微核試驗(yàn)。采用連續(xù)兩周腹腔注射染毒,于停藥后 24 小時(shí)內(nèi)處死小鼠。參照改良的小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)方法2進(jìn)行。頸椎脫臼法處死小鼠，分離附睪，分別置于盛有

13、1ml0.9%生理鹽水的 24 孔板中，輕輕撕開(kāi)附睪被膜，緩慢搖晃 24 孔板數(shù)次，靜置 35min，在懸液中加入 1%伊紅溶液 80l 混勻染色 1520min 后，取 1 滴置于清潔的玻片上，均勻推片，空氣自然干燥后，用中性樹(shù)膠封片，油鏡鏡檢。每只動(dòng)物觀察 300 個(gè)精子細(xì)胞。精子畸變類(lèi)型包括無(wú)鉤、香蕉形、無(wú)定形、胖頭、雙頭、雙尾、尾折疊等。2 2 結(jié)果結(jié)果2.1 龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的影響結(jié)果可見(jiàn)表 1 圖 1， G0/G1期細(xì)胞比率隨劑量增加而不斷升高,S 期和 G2/M期比率均有下降，細(xì)胞被阻滯在 G0/G1期，影響 DNA 的合成。龍葵堿各組與陰性組都有顯著性差異。表表 1 1

14、 龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的影響龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的影響(xs,n=3)(xs,n=3)Tab1 The effect of solanine on cell cycle of myeloid cell in male miceGroup G0/G1(%) S(%) G2/M(%)Control 65.988.43* 27.937.50* 6.092.03*1/8LD50 80.310.46* 17.010.74* 2.850.58*1/4LD50 82.192.94* 16.803.27* 1.011.02*1/2LD50 82.450.35* 16.780.73* 0.770.81*

15、CP 86.450.59* 12.700.26* 1.140.31*注：*：Compared with negative control P0.01。 Fig.1-1 cell cycle of mices marrow cells in 1/8LD50 Fig.1-2 cell cycle of mices marrow cells in 1/4LD50Fig.1-3 cell cycle of mices marrow cells in 1/2LD50 Fig.1-4 cell cycle of mices marrow cells in CPFig.1-5 cell cycle of m

16、ices marrow cells in control 圖 1 龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的影響圖譜龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞周期的影響圖譜Fig1 The effect of solanine on cell cycle of myeloid cell in male mice2.2 龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響(表 1) 結(jié)果可見(jiàn)表 2，圖 2，由表 2 可見(jiàn)龍葵堿對(duì)小鼠骨髓 PCE 的微核率與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性(P0.05)。表表 2 2 龍葵堿對(duì)動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率的影響龍葵堿對(duì)動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率的影響Tab2 The effect of solanin o

17、n micronucleus of myeloid cell 組 別 劑量 動(dòng)物數(shù) 受檢細(xì)胞數(shù) 含微核細(xì)胞數(shù) 微核率 (mg/kg體重) (只) (個(gè)) (個(gè)) (，xs)Control 6 6000 45 7.502.8811/8LD50 5.25 6 6000 76 12.671.751*1/4LD50 10.5 6 6000 88 14.672.582*1/2LD50 21 6 6000 109 18.174.401*CP 40 6 6000 167 27.835.115*注：微核率以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示 。Vs control (* p0.01 * p0.05) 胞內(nèi)微核 胞外微核胞外雙核

18、圖圖2 龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響龍葵堿對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響Fig 2 The effect of solanin on micronucleus of myeloid cell2.3 龍葵堿對(duì)小鼠精子畸形率影響 由表 3 可見(jiàn),受試物龍葵堿各劑量組的畸形率均高于陰性對(duì)照組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,高中劑量組與陰性組有顯著性(P0.05),低劑量組與陰性組差異不顯著。表表 3 3 龍龍葵葵堿堿雄雄性性小小鼠鼠精精子子畸畸形形發(fā)發(fā)生生率率的的影影響響Tab3 The effect of solanin on sperm deformity of spermatozoon in male mice

19、組 別 劑量 動(dòng)物數(shù) 受檢精子總數(shù) 畸變精子數(shù) 畸變率 (mg/kg) (只) (個(gè)) (個(gè)) (，xs)Control 6 1800 84 4.672.8281/8LD50 5.25 6 1800 130 7.227.8401/4LD50 10.5 6 1800 176 9.786.890*1/2LD50 21 6 1800 212 11.786.772*CP 40 6 1800 734 40.7817.072*注：畸形率以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示 。Vs control (*; p0.01 *; p0.05) 正常精子 不定型和雙尾 香蕉型 卷曲和無(wú)鉤 圖圖 3 3 龍龍葵葵堿堿雄雄性性小小鼠鼠精

20、精子子畸畸形形發(fā)發(fā)生生率率的的影影響響Fig3 The effect of solanin on sperm deformity of spermatozoon in male mice3 3 討論討論流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)術(shù)是利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞等生物粒子的理、化及生物學(xué)特性進(jìn)行分析的方法。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)是研究外來(lái)化合物毒作用機(jī)制的重要手段。本實(shí)驗(yàn)采用 PI 染色,流式細(xì)胞儀測(cè)定龍葵堿作用于骨髓細(xì)胞后的周期變化情況。結(jié)果表明，龍葵堿各組與陰性組都有顯著性差異。由圖 1 可看出 G0/G1期細(xì)胞比率隨劑量增加而不斷升高,S 期和 G2/M 期比率均有下降。這表明細(xì)胞被阻滯在 G0/

21、G1期，影響 DNA 的合成，進(jìn)而影響 G2/M 期，使進(jìn)入這一期細(xì)胞數(shù)減少。表明了龍葵堿對(duì)骨髓細(xì)胞周期可產(chǎn)生明顯的干擾，證明 DNA 的合成受到影響。微核實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)外來(lái)化合物對(duì)染色體損傷的重要方法，目前已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。微核是細(xì)胞的染色體發(fā)生斷裂后，細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂時(shí)，染色體片段不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，而在細(xì)胞漿中形成直徑小于 1/3 的，嗜色與主核一致，完全與主核分開(kāi)的圓形或卵圓形的微小核。各種理化因素包括化學(xué)毒性物質(zhì)損傷、放射線照射以及細(xì)胞組成成分缺乏3使細(xì)胞的 DNA 復(fù)制和染色體的分裂受到破壞，紡錘絲的功能受到影響，產(chǎn)生微核，是染色體畸變?cè)陂g期中表現(xiàn)出的一種損傷類(lèi)型，微核

22、率可以反應(yīng)致畸因素對(duì)細(xì)胞的損傷程度和染色體的穩(wěn)定性4。Sato N 等認(rèn)為微核可以是細(xì)胞凋亡的產(chǎn)物，當(dāng)致畸因素導(dǎo)致凋亡基因激活，內(nèi)切酶激活，切割 DNA，形成細(xì)胞核碎片，最終導(dǎo)致許多微核5。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)整體遺傳水平的小鼠體內(nèi)骨髓微核實(shí)驗(yàn)研究，說(shuō)明龍葵堿高中低各組與陰性組對(duì)比有不同程度的誘變效應(yīng)。 小鼠精子畸形試驗(yàn)是檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)生殖細(xì)胞不同時(shí)期誘變性的一種體內(nèi)實(shí)驗(yàn),由于其對(duì)已知的誘變劑高度敏感和對(duì)已知的致癌原因有高度的特異性而在國(guó)內(nèi)外毒理學(xué)研究工作中廣泛應(yīng)用。精子的成熟是一個(gè)依賴于附睪微環(huán)境的復(fù)雜過(guò)程。藥物對(duì)附睪的影響可能是導(dǎo)致不育的原因之一,但對(duì)睪丸精子細(xì)胞的作用可能是導(dǎo)致精子數(shù)量和活力

23、下降的主要原因，主要是影響精子細(xì)胞的變形過(guò)程6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三個(gè)劑量組的精子畸形率均高于陰性對(duì)照組，高中劑量組與陰性組有顯著性(P0.05),但低劑量組與陰性組差異不顯著，說(shuō)明龍葵堿可以透過(guò)血-生殖腺屏障而對(duì)生殖細(xì)胞-精子的發(fā)育造成影響，干擾精子正常形成與成熟，具有生殖毒性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)揭示了龍葵堿確實(shí)可以對(duì)哺乳動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞周期產(chǎn)生干擾，使細(xì)胞 DNA 合成受到阻滯。在的雄性小鼠骨髓微核和精子畸形組合實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)了龍葵堿可以使細(xì)胞的 DNA 復(fù)制和染色體的分裂受到破壞，具有細(xì)胞毒性。 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1 Gi Y B. Pharmacolog and application of active component in compound traditional chinese medicine(中藥有效成分藥理與應(yīng)用)M.Haerbin: Heilongjiang Science and Technology Press, 1995:433. 2 Wei Q，F(xiàn)an R Q，Yang X F et al.