動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法

1、附件6動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法（征求意見稿）1范圍本方法規(guī)定了動(dòng)物源性食品中喹諾酮類物質(zhì)的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。本方法適用于生乳、巴士殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、 氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、惡喹酸殘留的 快速測(cè)定。2原理本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的喹諾酮類物質(zhì)與膠體金標(biāo)記的特異性抗體 結(jié)合，抑制了抗體和檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化，通過(guò) 檢測(cè)線與控制線（C線）顏色深淺比較，對(duì)樣品中喹諾酮類物質(zhì)進(jìn)行定性判定。3試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析

2、純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 乙腈。3.1.2 甲酸。3.1.3 分散固相萃取劑I :分別稱取硫酸鎂 18g、醋酸鈉4.5g放于研缽中研碎。3.1.4 分散固相萃取劑II :分別稱取硫酸鎂 27g、N-丙基乙二胺（PSA）4.5g放于研缽中 研碎。3.1.5 甲酸-乙腈溶液：98mL乙腈中加入2mL甲酸，混勻。3.1.6 甲醇 L。3.1.7 稀釋液：脫脂奶粉：水（1 : 10）。3.2 參考物質(zhì)喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見表1,純度為9%。表1喹諾酮類參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量序

3、號(hào)中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子量1洛美沙星lomefloxaci n98079-51-7C17H19F2N3O3351.352培氟沙星pefloxac in6159-55-3C17H20FN3O3333.363氧氟沙星ofloxac in82419-36-1C18H20FN3O4361.374諾氟沙星no rfloxac in70458-96-7C16H18FN3O3319.335達(dá)氟沙星dano floxac in112398-08-0C19H 20FN3O3357.386二氟沙星difloxaci n5522-39-4C28H33N 3F2449.587恩諾沙星en rofl

4、oxaci n93106-60-6C19H 22FN3O3359.168環(huán)丙沙星ciprofloxaci n85721-33-1C17H18FN3O3331.139氟甲喹flumeq uine42835-25-6C14H12FNO 3261.2510惡喹酸oxoli nic acid14698-29-4C13H11NO 5261.23注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制喹諾酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL ）:分別精密稱取喹諾酮類參考物質(zhì)（3.2）適量，置于50mL燒杯中，加入適量甲醇（）超聲溶解后，用甲醇轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1mg/mL的喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備

5、液。-20 C避光保存，有效期 6個(gè)月。喹諾酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中間液 （1卩g/mL :分別吸取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 （1mg/mL ） （） 100 X于100mL容量瓶中，用甲醇（）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為 1卩g/mL的喹 諾酮類標(biāo)準(zhǔn)中間液。3.4 材料3.4.1 金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。3.4.2 試劑條或檢測(cè)卡。4儀器和設(shè)備4.1 移液器：100 山、200 pL 和 1 mL。4.2 渦旋混合器。4.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速 紹000 r/min。4.4 電子天平：感量為 0.01 g。4.5 孵育器：可調(diào)節(jié)時(shí)間、溫度，控溫精度±C。4.6 讀數(shù)儀。4.7 氮吹儀。4

6、.8 環(huán)境條件：溫度15C35 C,濕度W0%（采用孵育器與讀數(shù)儀時(shí)可不要求環(huán)境溫度）。5分析步驟5.1 試樣制備液體乳直接用于測(cè)定，豬肉、豬肝、豬腎用組織搗碎機(jī)等攪碎后備用。5.2 試樣的提取5.2.1 生乳、巴士殺菌乳、滅菌乳 分別吸取同等體積的液體乳樣品與稀釋液混合后為待測(cè)液。5.2.2 豬肉、豬肝、豬腎準(zhǔn)確稱取 2.5 ±0.01g 均質(zhì)后的組織樣品于 15mL 離心管中，加入 5mL 甲酸 -乙腈溶液 （ 3.1.5 ），渦旋混合 1min ，振蕩 5min ， 4000rpm 離心 5min 。將上清液 2mL 轉(zhuǎn)入 10mL 離 心管中，分別加入 0.6g 分散固相萃取

7、劑 I（3.1.3） 漩渦混合 1min 、再加入 0.6g 分散固相萃取 劑11（3.1.4）后漩渦混合1min，靜止分層后取1mL于10mL離心管中，于氮吹儀 60C吹干后 用 1mL 樣品稀釋液溶解作為待測(cè)液。5.3 測(cè)定步驟5.3.1 檢測(cè)卡測(cè)定步驟5.3.1.1 將檢測(cè)卡平放入孵育器中。 小心撕開檢測(cè)卡的薄膜至指示線處， 避免提起檢測(cè)卡和海 綿。用移液器取待測(cè)液（5.2） 300 uL避免產(chǎn)生泡沫和氣泡。豎直緩慢的滴加至檢測(cè)卡兩 側(cè)任意一側(cè)的凹槽中，將粘箔重新粘好。5.3.1.3 蓋上孵育器的蓋子，孵育器上的計(jì)時(shí)器自動(dòng)開始計(jì)時(shí)，紅燈閃爍，孵育3 分鐘。5.3.1.4 取出檢測(cè)卡，不要

8、擠壓樣品槽放于讀數(shù)儀中，讀數(shù)前保持樣品槽一端朝下直到在讀 數(shù)儀上讀取結(jié)果，或從孵育器上取出后直接目視法進(jìn)行結(jié)果判定。5.3.2 試劑條與金標(biāo)微孔測(cè)定步驟吸取300 yL待測(cè)液（5.2）于金標(biāo)微孔（3.4.1 ）中，抽吸510次使混合均勻，將試劑 條（）吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，孵育 58min，從微孔中取出試劑條，進(jìn) 行結(jié)果判定。注：試劑條（或檢測(cè)卡）具體檢測(cè)步驟可參考相應(yīng)的說(shuō)明書操作。5.4 質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。5.4.1 空白試驗(yàn)稱取空白試樣，按照 5.2和5.3步驟與樣品同法操作。5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取空白試樣（精確至 O.OIg）置于具塞

9、離心管中，加入一定體積的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn) 中間液，使諾氟沙星終濃度為 6卩g/kg按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。6 結(jié)果判定6.1 讀數(shù)儀測(cè)定法按讀數(shù)儀說(shuō)明書要求操作直接讀取并進(jìn)行結(jié)果判定，6.2 目視法通過(guò)對(duì)比控制線（ C 線）和檢測(cè)線（ T 線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視判定示意圖 見圖 1。6.2.1 無(wú)效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試劑條/檢測(cè)卡無(wú)效。622陰性檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測(cè)線（T線）顏色與控制線（C線） 顏色相當(dāng)，表明樣品中喹諾酮類低于方法檢測(cè)限，判定為陰性。6.2.3 陽(yáng)性檢測(cè)線（T線）不顯色或檢測(cè)線（T線）顏色比控制線（C線）顏色

10、淺，表明樣品中喹諾 酮類的含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性。6.3 質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。圖1目視判定示意圖7結(jié)論當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。8性能指標(biāo)8.1 檢測(cè)限：生乳、巴士殺菌乳、滅菌乳、豬肉、豬肝、豬腎中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氟甲喹、噁喹酸為3卩g/kg8.2 靈敏度：靈敏度應(yīng) > 99%8.3 特異性：特異性應(yīng) > 95%、8.4 假陰性率：假陰性率應(yīng) < 1%8.5 假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率應(yīng) < 5%注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄 A。9其他本方法所述試劑

11、、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本 方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為 GB/T 21312-2007 動(dòng)物源性食品中 液相色譜 -質(zhì)譜 /質(zhì)譜法附錄A定性方法性能指標(biāo)計(jì)算方法表A.1性能指標(biāo)計(jì)算表樣品情況a檢測(cè)結(jié)果b總數(shù)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2顯者性差異（X ）272= (|N12-N21|-1 )/ ( N12+N21 ),自由度(df) =1靈敏度（P+, %）p+=N11/N1.特異性（P-, %）p-=N22/N2.假陰性率（pf-, %）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+, %）pf+-N21/N2=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c(N11+N22 ) / ( N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N :任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第