生物傳感與DNA陣列

1、生物傳感與DNA陣列生物傳感器（biosensors）是生物分析化學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域，它結(jié)合了生命科學(xué)、分析化學(xué)、物理學(xué)和信息科學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，能夠?qū)λ枰獧z測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行快速分析和追蹤。生物傳感器的基本原理生物傳感器結(jié)構(gòu)與原理待分析物生物功能膜分子識(shí)別引起的物理或化學(xué)量的變化換能器可測(cè)電信號(hào)圖8.1 生物傳感器的原理生物功能膜，又稱生物敏感膜（biosensitive membrane）或分子識(shí)別元件（molecular recognition element），是生物傳感器的核心器件，直接影響傳感器的功能和質(zhì)量。換能器的作用是將生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)變成可方便測(cè)量的電信號(hào)。生物學(xué)反應(yīng)

2、的信息是多元化的，包括各種生物、化學(xué)和物理信息，現(xiàn)代電子學(xué)、微電子學(xué)及傳感技術(shù)的成果為檢測(cè)這些信息提供了豐富的手段，為生物傳感器的設(shè)計(jì)提供了足夠的方法。表8.1 生物傳感器的分子識(shí)別元件分子識(shí)別元件(生物敏感膜)生物活性材料分子識(shí)別元件(生物敏感膜)生物活性材料酶全細(xì)胞組織細(xì)胞器各種酶類細(xì)菌、真菌、動(dòng)物與植物細(xì)胞動(dòng)物、植物的組織切片線粒體，葉綠體免疫物質(zhì)生物親和物質(zhì)核酸模擬酶抗體,抗原,酶標(biāo)抗原等配體，受體寡聚核苷酸高分子聚合物表8.2 生物學(xué)反應(yīng)信息與換能器生物學(xué)反應(yīng)信息換能器選擇生物學(xué)反應(yīng)信息換能器選擇離子變化電荷變化電阻變化、電導(dǎo)變化質(zhì)子變化氣體分壓變化熱焓變化離子選擇性電極電容檢測(cè)阻抗

3、計(jì)，電導(dǎo)儀場(chǎng)效應(yīng)晶體管氣敏電極熱敏電阻，熱電偶光學(xué)變化界面電容改變顏色變化(光學(xué)范疇)質(zhì)量變化力變化振動(dòng)頻率變化光纖，光敏管，熒光計(jì)交流阻抗分析儀等光纖，光敏管壓電晶體等微懸臂梁表面等離子體共振生物功能物質(zhì)與分子識(shí)別生物傳感器的分子識(shí)別器件，主要是指來(lái)源于生物體的生物活性物質(zhì)，包括酶、抗原與抗體和各種功能蛋白質(zhì)、抗體酶、核酸、催化性核酸、激素、微生物細(xì)胞、細(xì)胞器、動(dòng)植物組織等，當(dāng)它們被用作生物傳感器的分子識(shí)別器件時(shí)，具有對(duì)靶分子（待檢測(cè)對(duì)象）特異的識(shí)別功能。分子識(shí)別往往是生物體進(jìn)行各種簡(jiǎn)單反應(yīng)或復(fù)雜反應(yīng)的前奏。分子識(shí)別能力決定生物傳感器的選擇性和靈敏度。因此，了解和掌握生物功能物質(zhì)的性質(zhì)及進(jìn)行

4、分子識(shí)別的特征，如酶促反應(yīng)、免疫反應(yīng)、核酸與核酸反應(yīng)（雜交，hybridization）、離子在膜中選擇性傳輸和生物與藥物、生物分子間弱相互作用等，對(duì)研究和開發(fā)生物傳感器具有重要的指導(dǎo)意義。生物學(xué)反應(yīng)中的物理量的變化生物反應(yīng)常常伴隨一系列的物理量變化，如熱焓、光、顏色、阻抗等，利用這些物理量變化能夠設(shè)計(jì)一些精巧的傳感裝置。生物反應(yīng)的熱力學(xué)任何生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程都伴隨著熱力學(xué)變化，如分子異構(gòu)、分子間相互作用、生物催化反應(yīng)等都會(huì)引起系統(tǒng)內(nèi)部或外部的熱變化。生物分子三維結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起其功能變化，利用微量測(cè)熱法測(cè)量分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過(guò)程或前后的熱信息可以確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。生物發(fā)光生物發(fā)光(biolumi

5、nescence)是指生物體內(nèi)某些特殊物質(zhì)的氧化而產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。生物發(fā)光大多由熒光素酶(1uciferase)催化，如螢火蟲的ATP依賴性發(fā)光反應(yīng)等。E + ATP + LH2 E-LH2-AMP +PP E-LH2-AMP + O2 E-L-AMP + H2O +h2 顯色反應(yīng)生物反應(yīng)過(guò)程中的顏色變化包括生物體內(nèi)產(chǎn)生色素和生物體或酶與底物作用后生成有色物質(zhì)兩個(gè)方面。各種色素是由不同的生物合成途徑產(chǎn)生的，每一種途徑都包含若干生物化學(xué)反應(yīng)，每一種反應(yīng)都是由特殊的酶催化的。生物功能膜的制備生物膜的模型從層數(shù)上來(lái)分可分為單層膜、雙層膜和多層膜。單層膜主要是指Langmuir-Blodgett(L-

6、B)膜；脂雙層膜又包括平板雙層膜(planar bilayer)和脂質(zhì)體(1iposome)，平板雙層膜又可分為非支撐平板雙層膜(又稱黑膜，BLM)和支撐平板雙層膜(s-BLM)；多層膜主要指磷脂鑄膜(cast lipid film)。Langmuir-Blodgett(L-B)膜技術(shù)脂雙層膜多層磷脂膜固定化生物功能膜電子傳遞媒介體生物傳感器電子傳遞媒介體大致有兩類:生物體內(nèi)的天然介體。如細(xì)胞色素類(氧化型/還原型，red/ox)、輔酶NAD(P)/NAD(P)H、鐵硫蛋白III/鐵硫蛋白II等。底物分子脫下的氫，經(jīng)一系列中間傳遞體到達(dá)分子氧。每對(duì)中間傳遞體都能往復(fù)地接受氫或電子，以促進(jìn)全部生

7、物氧化過(guò)程的完成。非生物源介體，包括一些酸堿指示劑、有機(jī)染料、金屬絡(luò)合物等。循環(huán)伏安法循環(huán)伏安法通常采用三電極實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)即工作電極(working electrode)、對(duì)電極(counting electrode)和參比電極(reference electrode)。工作電極可以用金、鉑或碳電極等；對(duì)電極一般用鉑網(wǎng)；參比電極為飽和甘汞電極或銀/氯化銀電極。電極在使用前須清洗，工作電極用氧化鋁粉拋光，對(duì)電極用1 mol L-1硫酸在-0.1+1.1 V之間反復(fù)清洗，直至其循環(huán)伏安圖譜達(dá)恒定值，然后再用去離子水洗滌，伏安圖譜用電化學(xué)分析儀分析記錄。(a) (b)圖8.3 循環(huán)伏安法(a) 電位與時(shí)

8、間的關(guān)系，線性掃描電位掃至某電位值Em后，再回掃至原來(lái)的起始電位值Ei;(b) 典型的循環(huán)伏安圖(CV), 轉(zhuǎn)換點(diǎn)為回掃的開始電子傳遞媒介體生物傳感器圖8.4 電子傳遞媒介體傳感器的反應(yīng)過(guò)程無(wú)試劑生物傳感器圖8.5 三代電化學(xué)生物傳感器的響應(yīng)機(jī)理蛋白質(zhì)在電極上的直接電化學(xué)蛋白質(zhì)在金膠納米粒子修飾電極上的固定與直接電子傳遞圖8.6 膠體金納米粒子單層的組裝和蛋白質(zhì)在ITO電極上的固定.納米粒子在無(wú)試劑生物傳感器制備中的應(yīng)用生物傳感器的應(yīng)用生物傳感器的臨床診斷血糖測(cè)定乳酸測(cè)定尿素及尿酸測(cè)定谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)測(cè)定免疫傳感器一、免疫傳感器制備二、電化學(xué)免疫傳感器三、質(zhì)量檢測(cè)免疫傳感器四、熱量

9、檢測(cè)免疫傳感器五、光學(xué)免疫傳感器六、免疫傳感器的發(fā)展生物傳感器在發(fā)酵與食品工業(yè)中的應(yīng)用氨基酸類酒精測(cè)定維生素c與淀粉測(cè)定過(guò)氧化氫測(cè)定 果糖測(cè)定DNA陣列DNA陣列的原理DNA微陣列(DNA microarray)是生物芯片技術(shù)之一。它將無(wú)數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡核苷酸、cDNA或基因組DNA有序地高密度固定排列在載體上(玻璃、硅、塑料等硬質(zhì)載體)制成點(diǎn)陣，通過(guò)與樣品中同源核酸進(jìn)行分子雜交，一次性檢測(cè)和分析樣品中的大量序列。cDNA微陣列與寡核苷酸微陣列并稱為核酸微陣列(nucleic acid microarray)。與寡核苷酸微陣列一樣，cDNA微陣列也是利用Watson-Crick堿基配對(duì)原理，通

10、過(guò)分子雜交的化學(xué)過(guò)程產(chǎn)生微陣列信號(hào)，兩者所包含的微陣列均以DNA或RNA作為探針?lè)肿印DNA微陣列中的cDNA探針長(zhǎng)度一般為0.52.5 kb，用這樣的分子制備的微陣列可產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號(hào)。cDNA微陣列可以通過(guò)與靶分子雜交平行分析大量基因的mRNA表達(dá)譜，根據(jù)每個(gè)cDNA位置的熒光強(qiáng)度，可以定量測(cè)定對(duì)應(yīng)的mRNA水平。DNA陣列的制備方法主要有光引導(dǎo)原位合成法(light-directed synthesis)、壓電打印原位合成法(piezoelectric printing in situ synthesis)、合成后交聯(lián)法(off-chip DNA synthesis attachme

11、nt)和微點(diǎn)樣技術(shù)。1. 光引導(dǎo)原位合成法第一步，將載體表面氨基化或羥基化。第二步，在羥基上加光敏保護(hù)基團(tuán)，用光敏保護(hù)基團(tuán)將載體表面的氨基保護(hù)起來(lái)。第三步，當(dāng)光線(如紫外線)通過(guò)罩在載體上的光刻掩蔽物(mask)時(shí)，有光線通過(guò)的部分，光敏保護(hù)基團(tuán)脫去，氨基被活化并與加入的一端連有光敏保護(hù)基團(tuán)的脫氧核苷酸反應(yīng)，使該單體分子連接到載體表面的氨基上。2. 微點(diǎn)樣技術(shù)制備DNA陣列微點(diǎn)樣技術(shù)（micro spotting）是利用手工或自動(dòng)點(diǎn)樣裝置將預(yù)先制備好的寡核苷酸和cDNA樣品按一定排列規(guī)律點(diǎn)在經(jīng)過(guò)特殊處理的玻璃片或其它基片上，利用載體表面的活性基團(tuán)與核苷酸分子作用形成共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，除去多余寡

12、核苷酸分子并封閉多余活性基因，即制成DNA微陣列。DNA陣列的應(yīng)用DNA芯片不僅可以用于基因表達(dá)分析，揭示基因是否表達(dá)、上調(diào)或下調(diào)，了解完整的基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控過(guò)程，還可從上千個(gè)樣品中的數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因座中探查等位基因的異同，提供由于基因異常引起的疾病的信息，也可用于生物基因型分類和基因多態(tài)性、細(xì)胞因子、黏附分子、受體、離子通道、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物大分子化學(xué)、細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、翻譯調(diào)控、細(xì)胞凋亡、腫瘤鑒定，在疾病和腫瘤診斷、藥物靶標(biāo)篩選、藥物評(píng)價(jià)等方面有重要的用途。圖8.19 DNA陣列用于基因表達(dá)譜分析流程一、比較基因組研究分析基因組時(shí)，檢測(cè)和確定復(fù)雜DNA樣品中各種不同序列的相對(duì)豐度是非常困難的。

13、利用熒光標(biāo)記的DNA微陣列方法，可解決這個(gè)難題。將864個(gè)酵母基因組DNA的l克隆(占酵母基因組的75以上)排列在1.8 cm´ 1.8 cm的玻璃基片上，總共含有1744個(gè)點(diǎn)陣單元。在這種微陣列中，標(biāo)記不同熒光團(tuán)的兩套不同的分離酵母染色體可同時(shí)發(fā)生雜交。用激光熒光掃描儀檢測(cè)來(lái)自兩種熒光團(tuán)的雜交信號(hào)，可分析復(fù)雜的DNA樣品。該系統(tǒng)在全基因組的遺傳作圖、物理作圖和基因表達(dá)研究等方面有著廣泛用途。基因芯片可用于由于基因修飾而影響基因表達(dá)改變的研究，如腫瘤細(xì)胞中DNA 的異常甲基化可以導(dǎo)致一些癌基因及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的改變。Melanie等使用4000個(gè)基因的芯片GF211研究去甲基化處理

14、前后的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系的基因表達(dá)譜證實(shí)了DNA異常甲基化是導(dǎo)致nm23-H1表達(dá)下調(diào)的原因之一。二、腫瘤研究中的應(yīng)用人黑色素瘤細(xì)胞系UACC-903的致瘤特性可以通過(guò)導(dǎo)入正常的6號(hào)染色體而得到抑制。DeRisi等171構(gòu)建了含1161個(gè)cDNA探針的高密度微陣列，研究了引入6號(hào)染色體的黑色素瘤細(xì)胞系中與腫瘤抑制相關(guān)的基因的表達(dá)差異。用于雜交的熒光探針來(lái)源于兩種細(xì)胞mRNAUACC-903和UACC-903(+6)，并標(biāo)記了不同的熒光素。分析與陣列上每個(gè)基因雜交的熒光信號(hào)，可確定每個(gè)基因?qū)?yīng)的兩種mRNA樣品中的相對(duì)豐度。那些以前未發(fā)現(xiàn)的特定基因表達(dá)的改變則提供了進(jìn)一步研究這些細(xì)胞致瘤表型遺

15、傳基礎(chǔ)的線索。Khan等用含有1238個(gè)cDNA的微陣列研究了一組共7個(gè)泡狀橫紋肌肉瘤(ARMS)細(xì)胞系的基因表達(dá)譜。采用多維測(cè)度法(multidimensional scaling)描述該細(xì)胞系在二維歐氏空間里的相互關(guān)系，確定了ARMS細(xì)胞表現(xiàn)一致的表達(dá)譜，從而將這些細(xì)胞進(jìn)行聚類。通過(guò)檢查這些細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)這1238個(gè)基因中有37個(gè)基因在ARMS細(xì)胞中表達(dá)非常恒定，其中只有3種基因以前報(bào)道過(guò)在ARMS表達(dá)。這37種基因中，有的與ARMS中原發(fā)性(PAX3-FKHR)和繼發(fā)性(CDK4)遺傳改變均相關(guān)。Heiskanen等將cDNA微陣列技術(shù)、比較基因組雜交(CGH)技術(shù)和組織微陣列技術(shù)結(jié)合起來(lái)

16、，檢測(cè)到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2基因(FGFR2)在乳腺癌中的低頻擴(kuò)增。乳腺癌細(xì)胞系SUM-52中存在幾個(gè)高水平DNA擴(kuò)增位點(diǎn)，包括FGFR2所在的染色體區(qū)域10q26。首先利用CGH技術(shù)檢測(cè)基于細(xì)菌人工染色體克隆的微陣列，發(fā)現(xiàn)FGFR2在SUM-52細(xì)胞中有高水平擴(kuò)增，然后用含588個(gè)基因的cDNA微陣列檢測(cè)到FGFR2在SUM-52細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)(超過(guò)40倍)，最后用熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)了750例原發(fā)性乳腺癌標(biāo)本的組織芯片，結(jié)果顯示FGFP2只在1原發(fā)性乳腺癌患者體內(nèi)擴(kuò)增。三、在其它疾病研究中的應(yīng)用HeIler等用cDNA微陣列技術(shù)分析兩種炎性疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病)的基

17、因表達(dá)情況，cDNA微陣列是用挑選的可能對(duì)炎癥具有意義的基因以及表達(dá)于外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因制備的。培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞系、原代軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的mRNA水平提供了細(xì)胞因子、趨化因子、DNA結(jié)合蛋白和降解基質(zhì)的金屬蛋白酶的表達(dá)譜。通過(guò)微陣列技術(shù)對(duì)這兩種疾病組織樣品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了涉及其中的許多基因，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)白介素3(IL-3)、趨化因子Gro a和金屬蛋白酶基質(zhì)金屬?gòu)椥缘鞍酌傅纫蜃右矃⑴c了這兩種疾病。通過(guò)對(duì)外周血文庫(kù)鑒定發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與炎癥性腸病相比，金屬蛋白酶組織抑制劑、鐵蛋白輕鏈和鎂超氧化物歧化酶基因的表達(dá)有差異。四、在細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用Ichikawa等用從銅綠假單胞桿菌感染的型肺細(xì)胞系A(chǔ)549中提取的RNA制備熒光標(biāo)記探針，用高密度DNA微陣列(由1506個(gè)人cDNA克隆組成)監(jiān)測(cè)了感染的A549細(xì)胞中的基因表達(dá)，從中鑒定出細(xì)菌感染后差異表達(dá)的基因。陳永青等利用含有12800個(gè)