凍干基因工程α2a干擾素制造及檢定規(guī)程

1、凍干基因工程a 2a干擾素制造及檢定規(guī)程本品系用帶有人a 2a型干擾素基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌， 經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)及單克隆抗體親和層析后精制而成。用于治療某些病毒性疾病及部分腫瘤疾病。1菌種1.1菌種來(lái)源基因工程a 2a干擾素工程菌由帶有人 a 2a干擾素基因的重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌而來(lái)。投產(chǎn)的工程菌需經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。1.2菌種特性菌種表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)水平符合投產(chǎn)菌種要求。1.3制造用菌種庫(kù)的建立從原始菌種庫(kù)傳出，經(jīng)擴(kuò)大后凍干保存，或由上一代制造用 菌種庫(kù)傳出，擴(kuò)大后凍干保存作為制造用菌種庫(kù)， 但每次只限傳 三代。每批制造用菌種庫(kù)均進(jìn)行下列檢定，合格后方可投產(chǎn)。劃種LB瓊脂平板應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無(wú)

2、其他雜菌生長(zhǎng)。涂片革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡下觀察，應(yīng)為典型的革蘭氏陰性桿菌。對(duì)抗生素的抗性應(yīng)與原始菌株相符。電鏡檢查應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，并證明無(wú)支原體、病毒樣顆粒及其 他微生物污染。生化反應(yīng)應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀。干擾素的表達(dá)量在搖床培養(yǎng)，應(yīng)符合原始菌種的表達(dá)量。質(zhì)粒檢查應(yīng)做該質(zhì)粒的酶切圖譜，并應(yīng)與原始質(zhì)粒相符。表達(dá)的干擾素型別應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)抗a干擾素血清做中和試驗(yàn)，證明型別正確。1.4生產(chǎn)菌種從制造用菌種庫(kù)傳出供生產(chǎn)用的菌種，稱為生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種的制備及檢定取制造用菌種庫(kù)凍干菌種開(kāi)啟后劃種LB平板23塊，培養(yǎng)后挑取平板中510個(gè)菌落，分別培養(yǎng)后保存，然后每個(gè)菌落分 別進(jìn)行干擾素表達(dá)量測(cè)定，至少重

3、復(fù)一次，選出其中干擾素表達(dá)量最高的一份，供生產(chǎn)制備種子液用，其表達(dá)量應(yīng)符合原始菌種 的表達(dá)量。1.5種子液從生產(chǎn)菌種選出的菌種供做發(fā)酵用的稱“種子液”。種子液的制備：將項(xiàng)檢定合格的生產(chǎn)菌種，根據(jù)實(shí)際需要做擴(kuò)充 傳代，作為罐培養(yǎng)的種子液。2發(fā)酵培養(yǎng)2.1空罐滅菌和實(shí)罐滅菌嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)要求操作。2.2發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)為適于發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基， 根據(jù)菌種的抗生素抗性，培養(yǎng) 若中允許加入少量抗生素，但應(yīng)盡量避免含有(3椖邗0防囁股?。?P>2.3發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)根據(jù)工程菌和發(fā)酵工藝要求設(shè)置和變換各項(xiàng)培養(yǎng)參數(shù)3收集菌體用離心法或其他適宜方法收集菌體，菌體可在 ？/FONT>20C下保存1年。4菌

4、體裂解用鹽酸胍或溶菌酶或高壓勻漿泵等適宜方法裂解菌體。5制備粗制干擾素菌體裂解后經(jīng)離心所得上清液即為粗制干擾素。6純化粗制干擾素經(jīng)單克隆抗體親和層析等純化步驟后即精制成“干擾素半成品原液”。7 加白蛋白取干擾素半成品原液檢定合格后， 立即另入適量人白蛋白保護(hù)劑，即為“加人白蛋白半成品”，保存于 ?/FONT>30Co8稀釋、除菌過(guò)濾將“加人白蛋白半成品”用無(wú)熱原生理鹽水稀釋至所需濃度，補(bǔ)加人白蛋白，使最終含量1%-2%然后用0.22卩m孔徑濾膜除菌，除菌后抽樣進(jìn)行干擾素效價(jià)測(cè)定，熱原質(zhì)試驗(yàn)和無(wú)菌試驗(yàn)，合格后進(jìn)行分裝凍干。9分裝、凍干9.1 每支安瓿分裝1ml,內(nèi)含a 2a干擾素100或3

5、00萬(wàn)IU9.2 凍干過(guò)程制品溫度不得超過(guò) 33Co9.3 凍干后成品置10C以下干燥處保存，成品檢定合格后 進(jìn)行包裝。10半成品檢定每批半成品抽樣進(jìn)行10.110.8項(xiàng)檢定。啟開(kāi)新菌種生產(chǎn) 的前3批或生產(chǎn)條件有較大改變時(shí)進(jìn)行10.910.12項(xiàng)檢定。10.1 效價(jià)測(cè)定用細(xì)胞病變抑制法， Wish細(xì)胞/VSV為基本檢測(cè)系統(tǒng)，用國(guó) 家參考品校準(zhǔn)為IU o10.2 蛋白含量用Lowry法測(cè)定。10.3 比活性應(yīng)108lumg蛋白。10.4 純度10.4.1 電泳純度用非還原型SDS?/FONT>PAG法，加樣量不低于5卩g,經(jīng)掃描儀掃描純度應(yīng)在95%上，聚合體不得超過(guò)10%1042高效液相色

6、譜純度用280nm檢測(cè)，應(yīng)是一個(gè)吸收峰或主峰占總面積95%以上。10.5 分子量用還原型SDS?/FONT>PAG法,加樣量不低于5卩g, a 2a干擾素分子量應(yīng)為19KD± 10%10.6 殘余外源性DNA含量用同位素或生物素標(biāo)記探針?lè)y(cè)定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。10.7 殘余鼠IgG含量用酶標(biāo)或其他敏感方法測(cè)定，每劑量（20卩g）的鼠IgG含量應(yīng)在100ng以下。10.8 殘余工程菌蛋白含量用酶標(biāo)或其他敏感方法測(cè)定，殘余工程菌蛋白不得超過(guò)總蛋 白的0.02%。10.9 殘留抗生素活性半成品中不應(yīng)有殘余抗生素活性存在。10.10 肽圖測(cè)定應(yīng)符合a 2a型干

7、擾素圖形，批與批之間圖形應(yīng)一致。10.11 等電聚集測(cè)定等電點(diǎn)，a 2a型干擾素等電點(diǎn)應(yīng)5.76.7范圍內(nèi)。10.12 紫外光譜掃描檢查半成品的吸收光譜，批與批之間應(yīng)一致，a 2a干擾素的最大吸收光譜應(yīng)為280± 3nm11除菌半成品檢定11.1 效價(jià)測(cè)定同10.1項(xiàng)。11.2 無(wú)菌試驗(yàn)按生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行11.3 熱原質(zhì)試驗(yàn)按生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行，注射劑量按家兔體重 注射20萬(wàn)IU/kg，判定標(biāo)準(zhǔn)按該規(guī)程 4.1項(xiàng)要求進(jìn)行。12成品檢定12.1 外觀應(yīng)為白色或微黃色疏松體，另入1ml滅菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可見(jiàn)的不溶物。12.2 pH 值pH值應(yīng)為6.57.5。12.3 效價(jià)測(cè)定同10.1項(xiàng)。其效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的 80%150%12.4 水分含量應(yīng) w 3%( g/g )。12.5 鑒別試驗(yàn)用中和試驗(yàn)法，其抗病毒活性能被抗a 2a型干擾素血清所中和或用免疫印染法。12.6 HBsAg 檢測(cè)用敏感度為1ng/ml以下的試劑盒測(cè)定，應(yīng)為陰性。12.7 無(wú)菌試驗(yàn)同11.2項(xiàng)，每批抽樣不少于10支。12.8 熱原質(zhì)試驗(yàn)同11.3項(xiàng)。安全試驗(yàn)12.9.1 豚鼠試驗(yàn)用體重300400g豚鼠2只，每只腹側(cè)皮下注射干擾素1ml, 觀察7天，