電泳實際操作指導

1、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像實驗步驟和凝膠成像實驗步驟凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術。根據(jù)制備凝膠的材料: 瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳凝膠電泳 聚丙烯酰胺電泳一、瓊脂糖凝膠電泳一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖的孔徑大，可以分離長度為瓊脂糖的孔徑大，可以分離長度為100bp至至60kb的核酸片斷；的核酸片斷；聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（聚丙烯酰胺凝膠的孔徑小，可分離小片斷（5-50bp）的核酸。）的核酸。DNADNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷分子在堿性緩沖液中帶負電荷，把DNA樣品加入到一塊包含電解質的多孔支持介質（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于DNA分子的雙螺旋

2、骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動。在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與電荷效應與分子篩效應分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。1 1、實驗原理、實驗原理瓊脂糖瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。凝膠電泳不僅可分離不同分子質量的DNA， 也可以分離相

3、對分子質量相同，而構型不同的DNA分子。 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計樣品DNA濃度。 注意事項：注意事項：EBEB是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。實驗過程中操作要保持安靜，注意樣品不能混樣。實驗過程中操作要保持安靜，注意樣品不能混樣。2 2、實驗步驟、實驗步驟 1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。 將內槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心

4、地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固。 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。 用移液器吸取總DNA或質粒樣品xl于一次性手套上，再加入一定量的6X/10X loading buffer，混勻后，小心加入點樣孔。每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。 打開電源開關，調節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min：當指示劑跑過膠板的2/3，可終止電泳。 將凝膠放入E

5、B染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。植物總（核）DNA樣品應呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶。質粒DNA的存在形式有3種： 共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在； 開環(huán)DNA（ocDNA），此種質粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子； 線狀DNA，因質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成。因此質粒DNA電泳的結果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA 線狀DNA ocDNA。原質粒酶切后質粒ocDNA線狀DNAccc

6、DNA（1）瓊脂糖含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。（2）電泳速度快。（3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。（4）樣品易回收，常用于制備。3、瓊脂糖電泳的優(yōu)點v 配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來確定。一般瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.1kb60kb范圍內的DNA片段 瓊脂糖凝膠濃度與線性瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍分辨范圍 常用的電泳緩沖液常用的電泳緩沖液4 保存?zhèn)溆?常用的常用的6X6X載樣載樣緩沖液緩沖液 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚藍 ，0.

7、25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液二、凝膠成像二、凝膠成像 1 打開凝膠成像儀電源（機器后部），開電腦； 2 將染色后凝膠用水沖洗后，將凝膠放在透射板正中， 并關嚴暗倉門，打開紫外燈； 3 打開Quantity one軟件，點擊basic，F(xiàn)ile中選擇 Get Doc EQ，調節(jié)使圖象到達合適亮度、大小及清晰度； 4 待圖象最優(yōu)化時，成像freeze在屏幕上，關閉紫外燈， 點擊“Save”保存； 5 關閉軟件； 6 打開暗倉門，拉出透射臺，凝膠丟棄至專門垃圾桶， 插掉透射板上水跡； 7 關上暗倉門。1、具體步驟、具體步驟2、Quantity One 軟件軟件 是The Discovery Series 軟件家族的成員，它是一 個功能強大的靈活軟件包，可成像和分析一維電泳凝膠、斑點印跡、狹線 印跡和菌落計數(shù)。 Quantity One 軟件能定量和分析多種數(shù)據(jù)，包括從光密 度儀、儲能磷屏成像儀、熒光成像儀和凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)采集的放射性、化學 發(fā)光、熒光和染色等樣品。Quantity One提供自動分析功能以快速獲取高 質量結果