第5章免疫血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

1、第五章 免疫血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié) 凝集與沉淀反應(yīng)第二節(jié) 放射免疫測(cè)定技術(shù)第三節(jié) 免疫熒光技術(shù)第四節(jié) 酶免疫測(cè)定第五節(jié) 固相膜免疫測(cè)定凝集反應(yīng)： 細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞性抗原等顆粒性抗原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。一、 凝集反應(yīng)及其特點(diǎn)第一節(jié) 凝集與沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)過(guò)程：抗原抗體的特異性結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象凝集反應(yīng)特點(diǎn)：IgM的作用比IgG大數(shù)百倍IgG與抗原結(jié)合后，常不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱不完全抗體臨床意義：進(jìn)行細(xì)菌的抗原分析、鑒定及分型，也可應(yīng)用已知細(xì)菌檢查未知血清的抗體。多 克

2、 隆 抗 體單 克 隆 抗 體肌紅蛋白上清液肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象直接凝集反應(yīng)(direct agglutination)： 顆粒性抗原直接與抗體結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。二、 直接凝集反應(yīng)（一）玻片凝集試驗(yàn)+ +方法評(píng)價(jià):定性試驗(yàn)簡(jiǎn)便和快速敏感度低臨床應(yīng)用:菌種鑒定血清學(xué)分型血型鑒定（二）試管凝集試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)：半定量試驗(yàn)簡(jiǎn)便、快速敏感度低可有假陽(yáng)性臨床應(yīng)用：肥達(dá)氏試驗(yàn)：傷寒副傷寒外裴二氏試驗(yàn)：斑疹傷寒Wright test:布魯菌病交叉配血試驗(yàn)間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination)： 將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)，

3、在電解質(zhì)的作用下，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。載體種類：RBC（醛化）；聚苯乙烯膠乳顆粒（羧化）；金黃色葡萄球菌。三、 間接凝集反應(yīng)用抗原致敏載體-檢測(cè)抗體（一）間接凝集反應(yīng)的類型1、正向間接凝集試驗(yàn)用抗體致敏載體-檢測(cè)抗原2、反向間接凝集試驗(yàn)用抗原致敏載體-檢測(cè)抗原3、間接凝集抑制試驗(yàn)coagglutination test：以金黃色葡萄球菌菌體為反應(yīng)的載體。人及多種哺乳動(dòng)物（豬、兔、豚鼠等）血清中IgG抗體的FC段與菌體表面的A蛋白（SPA）非特異性結(jié)合后，IgG的兩個(gè)Fab段仍然暴露在菌體表面，保持著結(jié)合抗原的活性和特異性。當(dāng)與特異性抗原相遇時(shí)，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。SPA-(Fc)IgG(

4、Fab)-AbSPA：staphylococcal protein A4、協(xié)同凝集試驗(yàn)（二）正向間接血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)強(qiáng)度1/21/21/41/41/81/81/161/161/321/321/641/641/1281/1281/2561/2561/5121/5121/10241/1024Pos.Pos.Neg.Neg.TiterTiter64648 8512512290% -半衰期60.2d12.3y標(biāo)記方法簡(jiǎn)單復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備低廉昂貴測(cè)量條件簡(jiǎn)單復(fù)雜一、放射免疫分析1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*與Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力，且兩者的總量大于Ab結(jié)合位點(diǎn)，二者通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)方式與Ab結(jié)合；

5、隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低，二者變化成函數(shù)關(guān)系。 以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*-Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/T(BF)與Ag的量變存在著劑量-反應(yīng)曲線。2、實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定AgAg* *AgAg平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法AbAb體積溫度時(shí)間pHAg*-標(biāo)準(zhǔn)；Ag-樣品二抗體沉淀法二抗體沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 試劑法試劑法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響 操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì) 結(jié)合與游離標(biāo)記物的分離二、免疫放射分析1、基本原理：以過(guò)量125I標(biāo)記抗體與待測(cè)

6、抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng), 用固相免疫吸附劑對(duì)B或F進(jìn)行分離，其靈敏度和可測(cè)范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡(jiǎn)單。 2、單位點(diǎn) IRMA先用過(guò)量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用固相抗原結(jié)合游離的標(biāo)記抗體并將其分離, 測(cè)定上清液的放射量 3、雙位點(diǎn) IRMA先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過(guò)量的標(biāo)記抗體與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標(biāo)記抗體，測(cè)固相上放射性。 RIARIAIRMAIRMA標(biāo)記物抗原抗體原理競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)體系A(chǔ)g*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反應(yīng)動(dòng)力學(xué)慢快靈敏度相對(duì)低高檢測(cè)范圍窄寬1-2數(shù)量級(jí)特異性差（PcAb）

7、優(yōu)（McAb）標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合率與測(cè)值成反比結(jié)合率與測(cè)值成正比待測(cè)抗原大小分子二抗原決定簇IRMA與RIA比較 將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。第三節(jié) 熒光免疫技術(shù)（一）熒光免疫分析的基本原理均相熒光免疫測(cè)定時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光酶免疫測(cè)定非均相熒光免疫測(cè)定熒光偏振免疫測(cè)定熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)的類型熒光免疫測(cè)定液體樣品測(cè)定熒光抗體技術(shù)固體樣品測(cè)定直接法間接法雙標(biāo)記法熒光物質(zhì)ex（nm）em（nm）應(yīng)用異硫氰酸熒光素 (FITC)490495520530（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹

8、明 (RB200)570575595600（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)550620（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560595（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354430（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340613時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光免疫測(cè)定中常用的熒光物質(zhì) 時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖（二）時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定1、基本原理鑭系元素銪(Eu3+)（最常用）；釤(Sm3+)；鋱(Tb3+)；釹(Nd3+)；鏑(Dy3+)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景

9、110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA10002、標(biāo)記物常見(jiàn)熒光物質(zhì)的熒光壽命3、信號(hào)增強(qiáng)作用結(jié)合-二酮體Eu3+解離pH4熒光增強(qiáng)Eu3+標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物固相雙抗體夾心法原理示意圖固相抗體-待檢抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物在酸性增強(qiáng)液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。4、雙抗體夾心法待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒

10、光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。5、固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。6、固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法熒光偏振免疫測(cè)定原理示意圖 （三）熒光偏振免疫測(cè)定熒光酶免疫測(cè)定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖熒光酶免疫測(cè)定熒光物質(zhì)產(chǎn)生示意圖 酶標(biāo)記抗體或抗原，與固相載體包被的抗原或抗體特異性結(jié)合。洗去游離的酶標(biāo)物。加入底物，經(jīng)酶分解后生成熒光產(chǎn)物。（四）熒光酶免疫測(cè)定標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物 ex(nm) em(nm) 響應(yīng)信號(hào)堿性磷酸酶4-MUP4-MU36045010- 半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過(guò)氧化物酶H

11、PA二聚體3174140.03熒光酶免疫測(cè)定標(biāo)記用酶及熒光底物 固相抗體和酶標(biāo)記抗體與待檢抗原反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。1、雙抗體夾心法熒光酶免疫測(cè)定（雙抗體夾心法）示意圖 固相抗原和酶標(biāo)抗原與待檢抗體反應(yīng)，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。 2、雙抗原夾心法待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留下來(lái)，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。3、固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗

12、核抗體(斑點(diǎn)型)（五）熒光酶免疫技術(shù)的應(yīng)用1、自身抗體檢測(cè)寄生蟲(chóng)（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲(chóng)）細(xì)菌（藤黃微球菌 )2、病原體檢測(cè)腫瘤（人肝癌細(xì)胞）3、免疫病理檢測(cè)4、細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測(cè)以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。 酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析 第四節(jié) 酶免疫測(cè)定一、基本原理（一）常用的酶及其底物1、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法。四甲基聯(lián)苯胺 TMB。反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性。 2、

13、堿性磷酸酶（AP）對(duì)-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）。經(jīng)酶作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405 nm。 3、 - 半乳糖苷酶（-Gal）多用于均相酶免疫測(cè)定。4MUG。經(jīng)酶作用后生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量。（二）固相載體及其處理1、常用的固相載體塑料制品、微顆粒、膜載體。通過(guò)固相載體可以方便的將非均相酶免技術(shù)中游離的和結(jié)合的抗體（或抗原）酶標(biāo)記物迅速分離。2、固相載體的處理包被（coating）：將抗原或抗體結(jié)合于固相載體。封閉（blocking）：用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均

14、相非均相固 相 酶 免疫測(cè)定液 相 酶 免疫測(cè)定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量（三）酶免疫技術(shù)分類 均相酶免疫測(cè)定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測(cè)。非均相免疫測(cè)定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛。常用于傳染病的診斷：病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒；結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌。也用于一些蛋白質(zhì)的檢測(cè)：各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原）。（三）酶免疫測(cè)定的應(yīng)用 酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或

15、抗體的含量。常用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定 。二、均相酶免疫測(cè)定1、酶放大免疫測(cè)定技術(shù)EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique2、克隆酶供體免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzyme-linked immunosorbent assay（一）基本過(guò)程及試劑1、包被：固相的抗原或抗體 2、反應(yīng)：加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體。酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物） 3、洗滌：使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離4、底物顯色：定性或定量的分析。酶反應(yīng)的底物 1、雙抗體夾心法 方

16、法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色 應(yīng)用：二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等（二）ELISA檢測(cè)抗原的方法雙抗體夾心法測(cè)抗原E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、競(jìng)爭(zhēng)法 方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原E EE EE EE EE EE EE EE E1、間接法 方法：用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。 優(yōu)點(diǎn)：一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)

17、的抗體。 應(yīng)用：常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定。（三）ELISA檢測(cè)抗體的方法間接法測(cè)抗體E EE EE EE EE EE EE EE EE E2、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似 應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體3、競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法 應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè) 應(yīng)用于病原體急性感染診斷中的IgM型抗體、甲型肝炎HAV-IgM抗體、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體的檢測(cè)。原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包被鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgMIgM類抗體類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記

18、特加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體異性抗原的抗體 底物顯色底物顯色 4、捕獲法捕獲法原理E EE EE EE EE E第五節(jié) 固相膜免疫測(cè)定一、常用的固相膜及其特點(diǎn)玻璃纖維素(fiberglass)，尼龍(nylon)，聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ，PVDF)，硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)多孔性-毛細(xì)管作用非共價(jià)鍵高度吸附抗體或抗原- 高度敏感性易于漂洗- 操作簡(jiǎn)便固相NC膜 利用金溶膠中金顆粒高電子密度的特性，使其與抗體結(jié)合。顯微鏡下，金標(biāo)蛋白結(jié)合處可見(jiàn)黑褐色顆粒。當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。二、免疫金標(biāo)記技術(shù)Immunogold labelling techique 陽(yáng)性陰性固相膜 固相抗原待測(cè)抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG 固相抗人IgG抗體IFA-雙抗體夾心法原理圖三、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)dot immunogold filtration assay, DIGFA/IFA金洗樣