內(nèi)毒素光度測定法檢查技術(shù)-文檔資料

1、Page 1光度測定法光度測定法BET檢查技術(shù)檢查技術(shù)湛江安度斯生物有限公司2009年3月2022-3-7Page 21、光度測定法方法學(xué)分類2、光度測定法原理3、動態(tài)比濁法BET4、終點比色法BET2022-3-7Page 31、光度測定法方法學(xué)分類光度測定法（定量法檢測）濁度法顯色法動態(tài)濁度法終點濁度法動態(tài)顯色法終點顯色法(比濁法)(比色法)2022-3-7Page 42、光度測定法原理光電轉(zhuǎn)換原理 光度測定法是利用鱟試劑與內(nèi)毒素的混合物在反應(yīng)過程的透光度變化與內(nèi)毒素濃度的關(guān)系來定量檢測內(nèi)毒素的一種方法。 當(dāng)一束光線進入如下光電轉(zhuǎn)換裝置時，該裝置將產(chǎn)生電流I，我們稱I為透光強度。入射光入射

2、光反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物透射光透射光光電池光電池I透光容器透光容器2022-3-7Page 5設(shè)：初始時的透光強度為Is，某時刻的透光強度為It定義1：透光度（Rt）： Rt=It/Is(%) 初始時It=Is，Rt=100%，Rt曲線變化趨勢是由高至低。 定義2： 吸光度(OD)： OD= -lg(It/Is) 初始時It=Is，OD=0，OD曲線變化趨勢是由低至升高。選擇不同的參數(shù)(Rt或OD)將得到不同變化趨勢的動態(tài)曲線。T(分分)IsItIeI2022-3-7Page 6TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)的動態(tài)曲線(Rt-T曲線)以透光度（Rt）為縱座標(biāo)，時間（T）為橫座標(biāo)，把TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)

3、混合液透光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動態(tài)曲線如圖：Rt（%）T（分）（分）動態(tài)曲線動態(tài)曲線100孕育期孕育期反應(yīng)期反應(yīng)期結(jié)束結(jié)束2022-3-7Page 7TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)的動態(tài)曲線(OD-T曲線)以吸光度（OD）為縱座標(biāo)，時間（T）為橫座標(biāo)，把TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液吸光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動態(tài)曲線如圖：ODT（分）（分）動態(tài)曲線0孕育期孕育期反應(yīng)期反應(yīng)期結(jié)束結(jié)束2022-3-7Page 8動態(tài)曲線的特點把標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備成三個濃度C1、C2、C3（ C1C2C3 ），分別與TAL反應(yīng)，描繪出反應(yīng)的動態(tài)曲線如下圖：C3Rt（%）T（分）（分）

4、C2C1分析動態(tài)曲線可看出：內(nèi)毒素濃度越高，孕育期越短；內(nèi)毒素濃度越高，反應(yīng)期曲線越陡；1.內(nèi)毒素濃度越高，進入結(jié)束期越快。2022-3-7Page 9光度測定法BET試驗的相關(guān)變量C3100Rt（%）T（分）（分）C2C1相關(guān)變量： 內(nèi)毒素濃度(C) 透光度(Rt或OD) 反應(yīng)時間(T)2022-3-7Page 101）動態(tài)法原理固定透光度(Rt)，建立內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-T曲線），用供試品的反應(yīng)時間比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。這里的反應(yīng)時間是指反應(yīng)混合液的透光度到達預(yù)設(shè)透光度值（Rt）的時間?；貧w分析回歸分析Rt%預(yù)設(shè)透光度值預(yù)設(shè)透光度值R0T1T2T3921

5、00T(分分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線2022-3-7Page 11（2）測定樣品內(nèi)毒素濃度（Cs）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品(S)反應(yīng)，得到反應(yīng)時間Ts，比對C-T關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cs。比對標(biāo)準(zhǔn)曲線比對標(biāo)準(zhǔn)曲線TsT(分分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT922022-3-7Page 122）終點法原理固定反應(yīng)時間（T），建立內(nèi)毒素濃度與透光度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-Rt曲線），用供試品的透光度比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。Rt(%)T(分分)C1C2C3100R1R2R

6、3預(yù)設(shè)反應(yīng)終止時間預(yù)設(shè)反應(yīng)終止時間T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-KC回歸分析回歸分析（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線2022-3-7Page 13（2）測定樣品內(nèi)毒素濃度（Cx）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品（X）反應(yīng)，得到透光度值Rx，比對C-Rt關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cx。CxToT(分分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-KCRxCx比對標(biāo)準(zhǔn)曲線比對標(biāo)準(zhǔn)曲線2022-3-7Page 143、動態(tài)比濁法試驗儀器及器具 動態(tài)微孔平板儀或試管儀 BET軟件 微孔平板、反應(yīng)試管等2022-3-7Page 15英國Lab Kinetics公司ATi動態(tài)試管儀, 96孔湛江安

7、度斯公司開發(fā)的BET專用軟件“生物探針-2002” 2022-3-7Page 16美國Charles River Endosafe 便攜式檢測系統(tǒng)（PTS）美國 BioTek公司超級酶標(biāo)儀，ELx808IU,使用96孔微孔板2022-3-7Page 17LKM細菌內(nèi)毒素動態(tài)試管儀 制造商：英國萊伯金耐特公司（Lab Kinetics Ltd.） 世界上第一臺動態(tài)試管儀的生產(chǎn)商 目前世界上銷量最大的動態(tài)試管儀 已經(jīng)取得醫(yī)療器械許可證 完善的售后服務(wù)1、體積小巧，占用空間??；、體積小巧，占用空間?。?、恒溫性能、光學(xué)性能精密，、恒溫性能、光學(xué)性能精密， 各孔溫度均在各孔溫度均在370.2， 這是國

8、內(nèi)同類儀器無法達這是國內(nèi)同類儀器無法達 到的。到的。3、配有專業(yè)的、操作簡單的軟、配有專業(yè)的、操作簡單的軟 件系統(tǒng)。件系統(tǒng)。2022-3-7Page 18ELx808IU型動態(tài)酶標(biāo)儀 制造商：美國伯騰公司（BioTek） 功能強大的細菌內(nèi)毒素檢測儀器 豐富的面板操作及數(shù)據(jù)分析，無需電腦可獨立操作 可使用多個波長同時分析2022-3-7Page 19動態(tài)比濁法試驗程序1、器具的準(zhǔn)備2、驗證試驗 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗 干擾試驗3、檢查法2022-3-7Page 201）試驗器具的準(zhǔn)備器具分類器具分類器具名稱器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑875mm或1075mm）稀釋容器大口徑玻璃試管移液器具刻度吸

9、管及洗耳球，或移液器及無熱原吸頭等其他試管架、酒精燈、異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標(biāo)記紙等凡是與供試品或反應(yīng)試劑接觸的器具，必須經(jīng)除熱原處理。通常玻璃器具需經(jīng)250 、60分鐘的干烤處理2022-3-7Page 212）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗試驗?zāi)康?驗證實驗室的條件是否滿足BET試驗的要求 驗證實驗人員的實驗技能是否滿足BET試驗的要求 驗證實驗所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET水等）是否滿足BET試驗要求Page 221、試劑2022-3-7Http:/Page 22試劑名稱試劑名稱廠家廠家裝量裝量規(guī)格規(guī)格動態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10EU/m

10、l0.03EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素0.003EU/ml2022-3-7Page 232、反應(yīng)項目將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備成至少3個濃度的稀釋液，相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限實驗前，先預(yù)熱動態(tài)儀，使其達到反應(yīng)溫度項 目平行管陰性對照溶液(D)O OO O OO O OO O O內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（C）(EU/mL)0.030.252.02022-3-7Page 243、溶液C的制備E1003.6ml WE100.4ml3.2ml WE20.8ml2.8ml WE0.250.4ml

11、2.8ml WE0.030.4ml30s0.4ml30s0.4ml30s0.8ml 30s0.4mlBET水1.0ml2.8ml2.8ml3.6ml3.2mlCSE混合5分鐘E10E2E0.25E0.03CSE/E1002022-3-7Page 254、鱟試劑的準(zhǔn)備 取TAL 1支，用砂輪在安瓿頸劃痕，擦拭后從安瓿頸處折斷（避免玻璃屑落入安瓿內(nèi)）； 用刻度吸管或移液器準(zhǔn)確吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入安瓿內(nèi)，輕輕搖勻，使內(nèi)容物全部溶解（避免產(chǎn)生氣泡）； 取反應(yīng)試管11支，按2.0 EU/ml、0.25 EU/ml、0.03EU/ml各濃度平行3管，NC平行2管標(biāo)記；2022-3-7Page

12、 265、軟件系統(tǒng)的設(shè)置進入動態(tài)儀系統(tǒng)軟件，根據(jù)試驗要求，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如反應(yīng)時間、預(yù)設(shè)透光度值等。填寫相關(guān)的實驗參數(shù)，使軟件進入待采集狀態(tài)2022-3-7Page 276、加樣反應(yīng) 先將復(fù)溶好的鱟試劑分裝至各反應(yīng)試管中，0.1ml/管； 分別將反應(yīng)溶液加入各相應(yīng)反應(yīng)管中，一般按照從低濃度到高濃度的順序加樣，首先加陰性對照溶液； 加樣完成后，將每支反應(yīng)管內(nèi)的混合液輕輕混勻后，插入動態(tài)儀中反應(yīng)TAL2.0EU/ml0.1ml0.1ml0.1ml0.25EU/mlCSE0.1ml0.03EU/ml0.1mlNCBET水0.1ml0.1ml0.1ml加樣順序從低濃度到高濃度2022-3-7Page

13、28在動態(tài)儀中插入反應(yīng)試管后，開始數(shù)據(jù)采集。 2022-3-7Page 297、結(jié)果判斷藥典要求 1、陰性對照的反應(yīng)時間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|0.980廠家建議值 3、變異系數(shù)CV%10%關(guān)于相關(guān)系數(shù)當(dāng)對一組數(shù)據(jù)作線性回歸分析時，以相關(guān)系數(shù)r表示其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性狀況，即該組數(shù)據(jù)的相關(guān)狀況。當(dāng)r值為正時，表示該組數(shù)據(jù)呈正相關(guān)關(guān)系；r值為負時，該組數(shù)據(jù)為負相關(guān)關(guān)系。當(dāng)r值的絕對值|r|=1時，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性最好。2022-3-7Page 30試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析2022-3-7Page 31試驗完成后進行數(shù)據(jù)分析2022-3-7Page 32試驗完成后進

14、行數(shù)據(jù)分析E0.3125E0.25E22022-3-7Page 333 ）干擾初篩試驗?zāi)康募霸?只有在無干擾情況下，樣品的內(nèi)毒素檢測結(jié)果才是有效的。 通過檢測從供試品原液到其MVD或MVC之間的稀釋液，計算內(nèi)毒素回收率，判斷供試品濃度對BET的干擾情況。2022-3-7Page 34試驗步驟1、供試品限值的確定2、試劑的選擇3、供試品最大有效稀釋的計算4、反應(yīng)溶液的制備5、加樣及反應(yīng)6、結(jié)果判斷2022-3-7Page 35干擾初篩試驗舉例供試品限值 硫酸慶大霉素，100ml/瓶，5000U/ml； 藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U2022-3-7Page 36試劑本試驗

15、使用鱟試劑的檢測范圍為100.03EU/ml，選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為2、0.25、0.03EU/ml試劑名稱試劑名稱廠家廠家裝量裝量規(guī)格規(guī)格動態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支100.03EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素0.003EU/ml2022-3-7Page 37最大有效稀釋倍數(shù)的計算光度測定法中，供試品最大有效稀釋倍數(shù)計算公式：MVD=cL/，其中為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點濃度本試驗，MVD=5000U/ml x 0.5EU/1000U0.03EU/ml=80（倍）2022-3-7Page 38各反應(yīng)溶液的制備溶液C的

16、制備E1000.4ml3.6ml WE100.8ml3.2ml WE20.4ml2.8ml WE0.25S原液0.4ml3.6ml WS101.4ml1.4ml WS201.4ml1.4ml WS401.4ml1.4ml WS80備用液0.4ml2.8ml WE0.03溶液A的制備E0.50.8ml2.4ml W備用液2022-3-7Page 39溶液B的制備E0.5S100.5ml0.5mlS20 E0.25E0.5S400.5ml0.5mlS80 E0.25E0.5S200.5ml0.5mlS40 E0.252022-3-7Page 40加樣及反應(yīng)取TAL兩支，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗中的方

17、法將其復(fù)溶；復(fù)溶鱟試劑后，運行軟件，使其進入待采集狀態(tài)；將兩支復(fù)溶好的鱟試劑溶液合并在一起，輕輕混勻避免產(chǎn)生氣泡；將鱟試劑液分裝至20支反應(yīng)試管中，0.1ml/管；將相應(yīng)的溶液A、B、C、D加至反應(yīng)管中，0.1mL/管，每濃度平行2管E0.03E0.25E2溶液C溶液DWS20S40S80S20E0. 25S40E0. 25S80E0. 25溶液A溶液A溶液A溶液B溶液B溶液B2022-3-7Page 41結(jié)果判斷藥典要求 1、陰性對照的反應(yīng)時間（TD ）大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間（T） 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|0.980 3、回收率R滿足：50% R 200%廠家建議值 4、變異系數(shù)

18、CV%0.980TD（3600s）T20倍回收率40倍回收率80倍回收率試驗有效試驗有效有干擾有干擾無干擾2022-3-7Page 444）干擾試驗根據(jù)干擾初篩試驗結(jié)果，確定選擇供試品的無干擾濃度選擇3批供試品進行干擾驗證試驗溶液的制備方法與干擾初篩試驗相同有干擾不理想無干擾2022-3-7Page 45溶液的制備A為稀釋倍數(shù)不超過為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液的供試品溶液B為加入為加入 m內(nèi)毒素且與內(nèi)毒素且與A溶液有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液溶液有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液C為用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液為用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液D為陰性對照為陰性對照編號編號內(nèi)毒素濃度內(nèi)毒素濃度

19、配制內(nèi)毒素的溶液配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)平行管數(shù)A無供試品溶液不少于2個B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點（或附近點）的濃度（設(shè)為m）供試品溶液不少于2個C至少3個濃度（最低點設(shè)定為）檢查用水每一濃度不少于2個D無檢查用水不少于2個2022-3-7Page 46反應(yīng)項目設(shè)置3批樣品都在同一濃度做干擾驗證試驗每濃度平行2管溶液編號項 目平行管D陰性對照O OC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.031O OE0.25O OE2O OA1S80O OB1S80E0.25O OA2S80O OB2S80E0.25O OA3S80O OB3S80E0.25O O2022-3-7Page 47接受標(biāo)準(zhǔn)藥典要求 1、陰性對照的反

20、應(yīng)時間（TD ）大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間（T） 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|0.980 3、各批樣品的回收率R滿足：50% R 200%廠家建議值 4、變異系數(shù)CV%10%2022-3-7Page 485）檢查法（日常檢查）根據(jù)干擾試驗結(jié)果，選擇無干擾的供試品濃度進行BET日常檢查各反應(yīng)溶液的制備及反應(yīng)項目設(shè)置與干擾試驗相同溶液編號項 目平行管D陰性對照O OC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.031O OE0.25O OE2O OAS80O OBS80E0.25O O2022-3-7Page 49結(jié)果判斷藥典要求 1、陰性對照的反應(yīng)時間(TD)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間(T) 2、標(biāo)準(zhǔn)

21、曲線的相關(guān)系數(shù)|r|0.980 3、各批樣品的回收率R滿足：50% R 200%廠家建議值 4、變異系數(shù)CV%10%若供試品溶液A所有平行管的內(nèi)毒素濃度平均值乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定，否則判供試品不符合規(guī)定 無復(fù)測要求2022-3-7Page 504、終點比色法BET原理 當(dāng)鱟試驗的顯色反應(yīng)到達預(yù)設(shè)的反應(yīng)終止時間（T0)時，反應(yīng)混合液的吸光度值（OD）與內(nèi)毒素濃度（C）成正比，利用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素建立OD-C的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定供試品的內(nèi)毒素含量。儀器 分光光度計 酶標(biāo)儀 37恒溫儀2022-3-7Page 51試驗程序1. 試驗準(zhǔn)備：儀器及用具等2. 確定藥品的細菌內(nèi)毒素限值（L）3. 選擇終點比色法試劑盒終點比色法鱟試劑顯色基質(zhì)（底物）工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE） 4. 計算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗6. 干擾試驗（驗證）7. 檢查法（日常檢查）2022-3-7Page 52終點比色法日常檢查舉例試劑及