分子生物學檢驗

1、第二章 臨床分子生物學檢驗標志物1. 分子生物標志物：指可以反映機體生理，病理狀態(tài)的核酸、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等生物分子，是生物標志物的一種類型。2. 中心法那么：指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復制過程。這是所有有細胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法那么。在某些病毒中的RNA自我復制(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過程(某些致癌病毒)是對中心法那么的補充。3. 基因組：是一個細胞或一種生物體的整套遺傳物質(zhì)，包括基因和非編碼DNA。4. 原核生物基因組特征：1原核生物基因組較小

2、：大小一般在106107堿基對之間；2原核生物的類核結(jié)構(gòu)：原核生物基因組DNA位于細胞中央的核區(qū)，沒有核膜將其與細胞質(zhì)隔開在蛋白質(zhì)的協(xié)助下，以一定的形式盤曲，折疊包裝起來，形成類核；3原核生物的操縱子結(jié)構(gòu)：原核生物的結(jié)構(gòu)基因大多數(shù)按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)排列于染色體上。結(jié)構(gòu)基因同其上游的調(diào)控區(qū)以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號，共同組成了一個基因表達單位，即操縱子結(jié)構(gòu)；4原核生物的結(jié)構(gòu)基因：原核生物的結(jié)構(gòu)基因中無內(nèi)含子成分，多數(shù)是單拷貝基因，基因與基因之間有重復序列存在；5具有編碼同工酶的基因：這類基因表達產(chǎn)物的功能相同，但基因結(jié)構(gòu)不完全相同；6含有可移動DNA序列：可移動的DNA序列通過不同的轉(zhuǎn)移方式發(fā)生

3、基因重組，改變生物體的遺傳性狀，使生物體更適應環(huán)境的變化；5. 質(zhì)粒：指細菌細胞染色體以外，能獨立復制并穩(wěn)定遺傳的共價閉合環(huán)狀分子；6. 人類基因組包括細胞核內(nèi)的核基因組3X109bp和細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體基因組16569bp，人類基因組中存在大量的非編碼序列和重復序列；7. 小衛(wèi)星DNA：由10100bp組成的重復單位重復幾十到幾百甚至幾千次，形成的15bp的短DNA，又稱可變數(shù)目串聯(lián)重復；8. 微衛(wèi)星DNA：核心序列為16bp，可以重復上百次，又稱短串聯(lián)重復；9. 多基因家族：指由某一祖先基因經(jīng)過重復和變異所產(chǎn)生的一組基因，在多基因家族中，某些成員并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因稱為假基因；

4、10. 多態(tài)性：當某種變異相對常見，在群體中的頻率高于1%時，那么稱為多態(tài)性，頻率低于1%的變異稱為突變；錯義突變，無義突變，RNA加工突變；11. 多態(tài)性類型：限制性片段長度多態(tài)性；小衛(wèi)星和微衛(wèi)星多態(tài)性；單核苷酸多態(tài)性主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性；拷貝數(shù)多態(tài)性指基因組中較大的片段200bp2Mb發(fā)生了拷貝數(shù)的變化；12. DNA甲基化： 1定義：指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程； 2作用位點：腺嘌呤的N6，胞嘌呤的N4，鳥嘌呤的N7，胞嘧啶的C5； 3作用機理：13. 微小RNA：是一類內(nèi)源性的具

5、有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約2025個核苷酸，在細胞內(nèi)主要發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用；14. 長鏈非編碼RNA：長度大于200bp的非編碼RNA；第四章：核酸雜交技術(shù)1. 融解溫度Tm：DNA的變性會在一個很狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，這一溫度范圍的中點被稱為融解溫度；Tm值的大小取決于核酸分子的G-C含量。G-C堿基含量越高，Tm值越高；2. 變性：在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，DNA分子成為單鏈，形成無規(guī)那么線團的過程；3. 復性：變性DNA只要消除變性條件，具有堿基互補區(qū)域的單鏈又可以重新結(jié)合形成雙鏈的過程；4. Southern印跡雜交：過程：1將待測定核酸分子通過一

6、定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物硝酸纖維素膜或尼龍膜上，即印跡；2固定于膜上的核酸同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程；原理：利用瓊脂糖凝膠電泳別離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反響顯色，從而檢測特定DNA分子的含量；特點：特異性和靈敏度高；5. Northern雜交靶核酸是RNA，Southern雜交靶核酸是DNA；第五章：核酸擴增技術(shù)1. 聚合酶鏈反響技術(shù)PCR：由美國Cetus公司K.Mullis博士于1983

7、年建立，它是一個能在試管內(nèi)模仿細胞內(nèi)核酸復制過程，也就是能在體外特異地擴增一段特定核酸序列的技術(shù)；2. PCR的根本原理：根據(jù)DNA半保存復制的機理和體外DNA分子于不同溫度下可變性，復性的性質(zhì)，通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，通過變性、退火、延伸三個步驟擴增目的DNA片段；3. PCR的根本過程： 1變性：將被復制的DNA片段在高于其熔點溫度Tm的條件下9495加熱，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂而解螺旋，形成兩條單鏈分子作為擴增反響的模板，以便與引物結(jié)合； 2退火：將反響體系的溫度降低至引物的熔點溫度以下<Tm 5，以便使引物能與模板DNA序列互補結(jié)合，形成雜交鏈； 3延伸：將反響體系

8、的溫度升至72，此時反響體希按照模板鏈的序列以堿基互補配對的原那么依次把dNTP加至引物的3端，在Taq DNA聚合酶的存在下，雜交鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈；4. 當溫度升至其熔點溫度Tm時熒光量急劇下降而形成熔點曲線，其波峰所在溫度即代表被檢DNA分子的Tm值。Tm值的大小取決于DNA分子的長度和其序列中G/C堿基含量；第六章：核酸實時定量檢測技術(shù)1. 實時熒光定量PCR技術(shù)：指在PCR反響體系中參加熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR反響過程，最后通過相關(guān)數(shù)據(jù)分析方法對目的基因進行定量分析的技術(shù)；2. 擴增曲線：指在實時熒光PCR擴增過程中，對整個PCR反響擴增過程進行了

9、實時的檢測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著反響時間的進行，檢測到的熒光信號的變化可以繪制成一條以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以PCR反響過程中實時熒光強度為縱坐標所做的曲線；3. 熒光閾值：指在實時熒光定量PCR擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在指數(shù)擴增階段的任意位置上；4. 循環(huán)數(shù)：PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號到達設定的熒光閾值所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)；5. 擴增效率：指PCR反響一個循環(huán)后的產(chǎn)物增加量與這個循環(huán)的模板量的比值，其值在01之間；6. 7. 第七章：核酸序列分析1. 雙脫氧鏈終止法測序原理：ddNTP比普通的dNTP在3位置缺少一個羥基，可以通過其5三磷酸基因摻入到正在增長的DNA

10、鏈中，但由于缺少3-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成3，5-磷酸二酯鍵。因此，正在增長的DNA鏈不在延伸，使這條鏈的延伸終止于這個異常的核苷酸處；2. 人類基因組測序的步驟：第八章：蛋白質(zhì)組學技術(shù)1. 蛋白質(zhì)組：包括一個細胞或一個組織或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì)；2. 蛋白質(zhì)組學：以蛋白質(zhì)為研究對象，從整體水平揭示細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)、表達水平和修飾狀態(tài)，研究蛋白質(zhì)間，蛋白質(zhì)與生物大分子之間的相互作用，揭示蛋白質(zhì)的功能與生命活動的規(guī)律；3. 雙向凝膠電泳：第一向電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同，通過等電聚焦將帶不同凈電荷的蛋白質(zhì)在PH梯度介質(zhì)中外加電場作用形成別離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。第一

11、向等電聚焦完成后，將凝膠包埋在SDSPAGE凝膠板上端，依據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同，在垂直或水平方向進行SDSPAGE，即第二次別離；4. 雙向凝膠電泳用于確定差異，質(zhì)譜法用于鑒別結(jié)構(gòu)；第十三章：單基因遺傳病的分子生物學檢驗1. 單基因遺傳病分類：常染色體遺傳，X連鎖遺傳，Y連鎖遺傳；2. 在分析基因結(jié)構(gòu)的變化時，通常用DNA作為檢測材料；在檢測轉(zhuǎn)錄水平異常時在，將RNA作為檢測材料；當基因較大時，突變區(qū)不甚明了時，也可直接從cDNA水平開始進行篩檢；3. 鐮刀細胞貧血的分子機制：患者由于珠蛋白基因中第6位密碼子存在單個堿基的突變，由原來的GAG變?yōu)镚TG，結(jié)果使珠蛋白鏈的第6位氨基酸殘基由原來的谷氨酸變?yōu)槔i氨酸，紅細胞發(fā)生鐮狀；4. 珠蛋白生成障礙性貧血的分子機制：第十五章：線粒體病的分子生物學檢驗：1 母系遺傳：在一個家系中，有缺陷的遺傳性狀通過母系成員從親代連續(xù)穩(wěn)定傳遞到子代的現(xiàn)象，即母親可以將有缺陷的遺傳性狀傳遞給子代，男性子代個體不再繼續(xù)傳遞，而女性子代個體可繼續(xù)將此有缺陷的遺傳性狀往下一代傳遞；2 遺傳早發(fā)：指越是嚴重的線粒體功能異常，其個體發(fā)病的年齡也將越早；3 遺傳瓶頸：線粒體在卵母細胞成熟時數(shù)目會出現(xiàn)銳減的現(xiàn)象；4 線粒體基因表達系統(tǒng)及特點：第十六章：腫瘤的分子生物學檢驗1. 原癌基因：指人類或其他動物細胞固有的一類