WesternBlot配方和方法

1、.Western Blot 配液：1. 10% SDS溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH2O 1ml加熱溶解，室溫保存，用后馬上擰緊瓶蓋。2. 10% 過硫酸銨:APS 0.1gDDH2O 1ml由于過硫胺酸會緩慢分解，最好新鮮配制，或隔周配制（也可每200微升EP分裝，4保存4W，-20保存1月）3. 1× 電泳緩沖液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸餾水溶解至1000ml，調(diào)整PH 8.3。冰箱內(nèi)可保存數(shù)月。4. 10 × 轉(zhuǎn)膜液（儲存液）甘氨酸 72.07gTris base 15.14gDDH2O 400ml加水至50

2、0ml， 儲存液不加甲醇，4保存。1 × 轉(zhuǎn)膜液 1L配制：10 × 轉(zhuǎn)膜液儲存液100ml，150ml甲醇，加DDH2O 750ml，PH 8.5，定容至總量1L5. 1 × 轉(zhuǎn)膜液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇 150ml加水定容至1000ml6. 10 × TBS： Tris base 12.1g NaCl 40g加水，用濃鹽酸調(diào)整PH至7.6后定容至500ml7. TBST： 1 × TBS/吐溫 = 1000/18. 封閉液： 脫脂奶粉 2g TBST 40ml配膠：先配分離膠，再配積層膠

3、。一般兩者同時配制，只是最后分離膠先加TEMED混合后立即灌膠，而積層膠放4，等分離膠凝固后再加TEMED混勻后灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據(jù)實驗當(dāng)時的溫度適當(dāng)調(diào)整） 2ml 5%積層膠3ml 5%積層膠5ml 8% 分離膠5ml10% 分離膠10% 兩塊膠5ml15%分離膠超純水 1.42.12.31.92.851.130Acr/Bic0.330.4951.31.72.552.51.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）1.31.30.951.31 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0.250.375

4、10SDS 0.020.030.050.050.0750.0510%APS（過硫胺酸） 0.020.030.050.050.0750.05TEMED 0.0020.0030.0030.0020.0030.002雙丙烯酰胺：丙烯酰胺摩爾比1：29配制時，SDS-PAGE有效分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用于60200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10%用于 1670kDa，15%用于1245kDa。步驟：（1） 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，用

5、洗潔精將板洗凈。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2） 配膠與上樣：先配分離膠，再配積層膠。1、 玻璃板對齊后放入制膠架中卡緊（一定要對齊，以免漏膠）。然后垂直卡在夾子上準(zhǔn)備配膠。2、 按前面方法配10分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，用槍吸取1ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶下緣以下5mm高度時即可，給積層膠留出足夠空間（梳齒長再加1cm）。然后膠上加一層去離子水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。）3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射

6、線時，說明膠已凝固（30min）。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上的水，再用去離子水洗滌數(shù)次，并用濾紙將水吸干。4、 按前面的方法配5的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平（梳子使用前保證干凈且干燥）。待到濃縮膠凝固后（室溫30min），將凝膠放入電泳槽中，小玻璃板面朝內(nèi)（若只跑一塊膠，則槽的另一邊要墊一塊塑料板，且有字的一面朝內(nèi)）。在上下槽內(nèi)加入電泳液，上槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過小玻璃板上緣，下槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過金屬絲，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡。加入電泳液后，兩手分別

7、捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5、 用電泳液沖洗一下濃縮膠，（目的是去除梳子遺留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成條帶變形） 可以前一天配膠備用，保鮮膜4度保存，可一周。6、制備樣品：測完蛋白濃度后，計算含2050g蛋白（根據(jù)自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量，一般為4050ug。）的樣品體積即為上樣量。取出上樣樣品至200l的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×（上樣緩沖液與樣品蛋白體積之比為1:4）。（上樣體積一般在10l與20l之間）（其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達到40l，膠做得很好的話，50l問題也不大）上樣前要將樣品100加熱5-15

8、min使蛋白變性，立即冰浴，然后低速離心5min。（可以使用PCR儀進行變性（95,10min）應(yīng)根據(jù)上樣緩沖液濃度的不同，制備樣品。樣品分裝成小管，儲于-80。蛋白質(zhì)在非變性條件下的電泳分離是由其分子量大小與電荷共同決定的，在變性條件下與SDS結(jié)合后，其電泳分離只由分子量大小決定。7、 加足夠的電泳液后準(zhǔn)備上樣。上樣之前一定要把上樣孔沖洗干凈，沖走未凝固的丙烯酰胺。用移液槍將樣品吸出，注意不要吸進氣泡。將槍頭插至上樣孔中加入樣品（上樣速度要快，防止樣品擴散導(dǎo)致相互影響，但上樣過快又會使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時要換槍頭，以免交叉污染）。一般marker（Fer

9、mentas的0671或0441）加6ul。為避免邊緣效應(yīng)，最好選擇中間的孔上樣。8、 電泳：將電泳槽與電泳儀相接，紅接紅，黑接黑。跑濃縮膠時用80V，到分離膠后用120V。溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜（一般讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好。當(dāng)然，不要局限于此說明）。電泳時間也取決于要檢測的蛋白分子量的大小。9、 轉(zhuǎn)膜（1）從負(fù)極（黑板）到正極（透明板）方向依次：纖維墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、纖維墊，呈三明治樣。在加有轉(zhuǎn)膜液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊纖維墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。（2） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張纖維墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（

10、一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起再墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（3） 將小玻璃板撬掉，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬（撬時一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠，根據(jù)需要橫向切膠，并根據(jù)膠的大小裁剪同樣大小PVDF膜，剪去膜的右上角作為標(biāo)記（當(dāng)剪去的角在右上方時有蛋白面朝上，在右下方時有蛋白面朝下）。如果樣本多，同時做幾張膜，可用鉛筆在膜下角標(biāo)ABCD或1234，這樣可以分出膜的正反和加樣順序。注意：裁濾紙和膜時一定要戴手套，因為

11、手上的蛋白會污染膜。將裁好的PVDF膜置于甲醇中浸一下才可使用。在膜上蓋3層濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個纖維墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)膜液中進行，要不斷的搟去氣泡。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）（最后做成的“三明治”千萬不能形成短路，不然有可能會短路燒壞轉(zhuǎn)膜裝置）。（4） 將夾子放入轉(zhuǎn)膜槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。轉(zhuǎn)膜時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。液面應(yīng)該沒過夾子上緣，在電泳槽周圍放置碎冰，打開電源，280mA ，1.5h。（1.應(yīng)根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時間，對于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時最好墊兩塊PVDF膜，以免轉(zhuǎn)膜過頭，

12、因為如果第一張膜上蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了，第二張膜上還有蛋白質(zhì)可以進行檢測；對于分子量大的蛋白，轉(zhuǎn)膜時間要長一點，開始最好也用兩塊膜，特別是務(wù)必注意加強降溫措施。當(dāng)然轉(zhuǎn)膜是要摸條件的，最好剛開始做的時候摸個轉(zhuǎn)膜的時間梯度。如果由于時間原因來不及做下面實驗，可以在4度下12V轉(zhuǎn)膜過夜）（2.PVDF膜建議使用0.22的小孔徑膜，不容易轉(zhuǎn)膜過頭）（3.不同的轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)移效率是不一樣的，所以換用轉(zhuǎn)膜裝置，最好再摸個條件）（4.轉(zhuǎn)膜時電極方向注意是膜正膠負(fù)）10、 考馬斯亮藍染膠（一般不需要做這步）轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋

13、白。 將膜晾干備用。11、封閉：洗膜：TBST洗膜一次。封閉：5%脫脂奶粉配制：TBST 40ml +脫脂奶粉2g。將NC膜（蛋白面朝下）移入盛有封閉液的平皿中，室溫?fù)u床孵育1h。12、洗膜：TBST洗膜一次。13、抗體孵育：孵育一抗：用5%脫脂奶粉-TBST按適當(dāng)比例(一般是1000:1)稀釋一抗（1ml 5%脫脂奶粉：1mlTBST加0.05g奶粉）。裁下一塊封口膜，折成小船鋪于濕盒中，將脫脂奶粉加到小船中，用移液槍把一抗注進奶粉溶液里，搖床上搖一會。膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡。搖床搖半小時后，放在濕盒中4過夜。洗膜：TBST，室溫下?lián)u床上35次×5-10min。孵育二抗：用5%脫脂奶粉-TBST按適當(dāng)比例（一般小鼠5000:1，兔2000:1）稀釋二抗。將脫脂奶粉加到小船中，把二抗注進奶粉溶液里，搖床上搖一會兒。膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫?fù)u床孵育1h2h。洗膜：TBST，搖床上洗35次×5-10min。14、曝光：（曝光的整個過程需