dld00蛋白定量BCA法-最強試驗protocol

1、蛋白定量ProteinQuantitation【蛋白定量的背景知識】“蛋白定量”即蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)定量根據(jù)其目的分為全蛋白質(zhì)的“總定量法”和特定蛋白質(zhì)的個別定量法”。蛋白定量是生物學實驗不可缺少的一部分。為驗證細胞裂解是否成功；2或為了將多個樣品進行平行實驗比較或標準化保存， 需對細胞裂解液進行蛋白定量；3為了判定蛋白的產(chǎn)量，需對純化好的蛋白進行定量；4為了將純化好的蛋白用生物素或者報告酶進行標記，同樣需首先對蛋白樣品進行定量，以保證標記反應在適當?shù)幕瘜W濃度下進行。蛋白定量分析涉及到生產(chǎn)科研的多個領域及行業(yè)，也是生物學科、食品檢驗及打擊摻假摻偽、臨床檢驗、診斷疾病和質(zhì)量檢驗中最常見的方法。|

2、【蛋白定量的方法】蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學和其他生命學科常涉及的分析內(nèi)容。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進行準確可靠的定量分析，是一項經(jīng)常進行的非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結構不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來了許多具體的因難。現(xiàn)測定蛋白質(zhì)含量方法有很多：根據(jù)物理性質(zhì)：紫外分光光度法；根據(jù)化學性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮服法、Folin-酚試劑法（Lowry法）、BCA法、膠體金法；3根據(jù)染色性質(zhì)：考馬斯亮藍染色法、銀染法；4根據(jù)其他性質(zhì)：熒光法；蛋白定量的測試方法有很多種，其中較為常見的有五種，分別是Br

3、adford法、Bradford斑點試驗、Coomassie斑點試驗、紫外分光度檢測法及BCA法這五種。當然，每種方法適用的情況都有所不同。實驗最常用的蛋白定量方法為BCA法和Bradford法（也就是考馬斯染色法）BCABCA 蛋白定量和 BradfordBradford 法蛋白定量的區(qū)別|(1)Bradford法測得的主要是堿性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA則沒有選擇性；該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)定量是相當精確的，特別是用于小分子多肽定量，如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污劑(裂解液)的濃度超過0.2%則影響定量結果。如TritonX-100,SDS,NP-40等。(2) BCA法 蛋 白 濃

4、度 定 量 是Cu2+ 在 堿 性 的 條 件 下 ， 可 以 被 蛋 白 質(zhì) 還 原 成Cu+(BiuretReaction),Cu+和獨特的BCASolutionA(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應。兩分子的BCA螯合一個Cu+,形成紫色的反應復合物。該水溶性的復合物在562nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。Bradford法蛋白定量是染料與蛋白質(zhì)結合后引起染料最大吸收波峰的改變，從465nm變?yōu)?95nm,光吸收增加。蛋白質(zhì)染料復合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度，最低檢出量為1口蛋白。染料與

5、蛋白質(zhì)的結合是很迅速的過程，大約需2min,結合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子，如K+,Na+,Mg2+,(NH4)2SO4,乙醇等物質(zhì)不干擾測定，而大量的去污劑如TritonX100,SDS等嚴重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當?shù)膶φ斩?。由于染色法簡單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應用于蛋白質(zhì)含量的測定。【內(nèi)參(基因/蛋白)的背景知識】WesternBlot實驗常用于檢測蛋白表達量、蛋白表達產(chǎn)物的正確性等。相對于其他檢測蛋白的方法而言WesternBlot實驗在蛋白的定性定量分析、 與“目的蛋白”量的比較方面更簡單一些。在定量分析時，為排除各樣本蛋白總量不同的干擾，WB的每

6、個樣本的“上樣量”(并不僅僅指上樣量的體積)即對應泳道的蛋白總量應該均一。因此需提前對各蛋白樣本進行定量，使得各樣本的蛋白濃度一致，如此WB時,當每泳道上樣體積一致時，則對應的蛋白總量也一致。作為Control,應選擇能在各個細胞都能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因(常見的內(nèi)參基因有&Actin,GAPDH等，具體需參考文獻)，如WB的結果顯示內(nèi)參基因一致，則表明本次實驗各泳道的蛋白總量一致，實驗也就具備了分析的前提和基礎。內(nèi)參即是內(nèi)部參照( (InternalControl),對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白( (HousekeepingProteins),它們在各組織和細

7、胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在WesternBlotting實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。雖然，順利的時候WesternBlot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩一一做不出結果、假陽性、結果出現(xiàn)多條帶、到底是一抗有問題還是二抗有問題畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應不像“1+1”那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性。所以，嚴謹?shù)腤estern

8、Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果的分析非常有用。特別是當實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮，怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker(用來確定蛋白條帶對應的分子量大小卜空白載體對照(如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照卜已知量標準產(chǎn)物的正對照，另外還有內(nèi)參?？墒怯捎诮?jīng)費限制或者偷懶的原因，國內(nèi)的不少人做WesternBlot往往省略參照，導致結果出現(xiàn)問題時無法分析結果，即便有結果也可能影響結果的分析。實際上內(nèi)參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用WesternBlot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件

9、是等量的細胞上樣，才有比較的基礎，特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析，所以需要內(nèi)參。在國外發(fā)表的文章中，WesternBlotting實驗結果須進行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不少科研人員在WesternBlotting實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA

10、、Bradford、Lowry等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry、BCA反應的還原劑(如DTT,疏基乙醇)相容，但是對去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Westernblotting實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。在WesternBlot中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組

11、織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個WesternBlot顯色或者發(fā)光體系是否正常。在 WesternBlottingWesternBlotting 實驗過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種：(1)第一種是超級簡便的標記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時加入HRP標記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可；(2)第二種是普通內(nèi)參，當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測， 然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體， 重新進行內(nèi)參蛋白的抗體

12、溫育、顯色檢測。(3)第三種(最常用)，當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行孵育，二抗孵育以及顯色。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulino一般我們選擇內(nèi)參與要檢測的目的蛋白的分子量最好相差10kDa以上。因此你要知道你檢測的蛋白的分子量來選擇合適的內(nèi)參?！?

13、amp;ActinActin、GAPDHGAPDH、TubulinTubulin 的具體應用】actin即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletalmuscleactin、alpha-cardiacmuscleactin、alpha-smoothmuscleactin和gamma-smoothmuscleactin,其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(&non-muscle)和gamma-non-muscleactin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-act

14、in分布就很少，心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。Beta-actin作為內(nèi)參是得到了公認的，這是針對大多數(shù)組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞漿內(nèi)，表達量非常豐富。盡管最近有一些文章已經(jīng)開始質(zhì)疑beta-actin作為內(nèi)參的有效性(疑似對于上樣量20的的蛋白區(qū)分能力下降)，但是發(fā)文章應該還是沒有問題的。至于其他的內(nèi)參也是可以考慮用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)是參與糖酵解的一種關鍵酶，而tubulin和actin類似，是細胞骨架的組成部分，但不是肌肉的主要成分，應該是一個代替品。上述三種內(nèi)參同時發(fā)生變化

15、的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內(nèi)參同時發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內(nèi)參如PCNA,TATA-boxbindingprotein(TBP)甚至線粒體的內(nèi)參來代替，當然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。不同異構體表達對蛋白的檢測是有很大的影響，買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實未必是抗體質(zhì)量的問題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的， 不同的公司選擇的片段不一樣。 以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C-端。選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-G

16、ly-Lys16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù)，主要有SantaCruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat#A197等)，ProSci(Cat#3779),CellSignaling(Cat#4967),AxxoraPLATFORM(BET-A300)等，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等)， 這類抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內(nèi)參時產(chǎn)生組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成

17、的。actin幾種異構體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性(90%)。&actin是分布于非肌細胞中的一種骨架蛋白，選擇作lactin內(nèi)參時首先得保證是組織廣泛表達的(尤其是做蛋白的組織表達譜時)。那么制備(-actin抗體的抗原應該是選用與actin其它異構體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用lactin的某一段小短肽作為免疫原，可能會因為選取的短肽在不同型actin之間保守與否，而導致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在，所得抗體就僅能檢測非肌細胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在，則此抗體除非肌細胞外，還可以檢測car

18、diac,skeletal,smoothmuscle細胞的actin。WesternBlot實驗中選擇內(nèi)參作為參照體系對于實驗結果的分析具有很好的說明性。內(nèi)參的選擇往往使用一些常見的持家基因（管家基因），常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、beta-actin等。WesternBlot實驗中內(nèi)參的選擇及其使用方法都會直接影響對實驗結果的分析。【BCABCA 法蛋白定量的原理】Cu2+在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成Cu+,Cu+和獨特的BCASolutionA（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應。從原來的蘋果綠色螯合成紫藍色的復合物。在562nm處顯示強烈的吸光性， 且吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)

19、有良好的線性關系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。BCABCA 法蛋白定量的工作范圍BCA法測定蛋白質(zhì)濃度的范圍是20醫(yī)g/m1200醫(yī)g/ml【碧云天 BCABCA 試劑盒特點簡介】碧云天BCA試劑盒官方說明http:/ 37c37c 生化培養(yǎng)箱；一般推薦每天上午裂解細胞，收取蛋白樣品，下午立刻行BCA法進行蛋白定量實驗，如此可以防止蛋白降解；如果裂解細胞第二天開始進行蛋白定量實驗，則務必檢查是否有足夠的冰；02.待檢測的蛋白樣品插置冰上且保存在 4c4c 冰箱待用；03.檢查預先配制的蛋白標準品是否夠用，如果不足，則重新配制；蛋白標準品在BCA試劑盒（碧云天）內(nèi)，由廠家提前配制好貯存溶液

20、，用于標準曲線的測定；具體步驟為：完全溶解蛋白標準品，取10口稀釋至100口使終濃度為0.5mg/ml。一般而言，蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡便起見，也可以用0.9%NaCl溶液或PBS稀釋標準品。 稀釋后的0.5mg/ml蛋白標準可以放置在-20C長期保存。根據(jù)實驗方案，標記相應的 EPEP 管；由于BCA法需制作標準曲線，故即便樣本量不大，也需要較多的EP管；如樣本量較大，以及需要雙梯度稀釋蛋白樣本時，則需要大量的EP管，因此需提前標記好待用；一般標準曲線8個；樣本則需標記3套EP管，20倍稀釋（1口樣品），10倍稀釋（2L樣品），最終的調(diào)平蛋白濃度（高濃度蛋白

21、樣品補齊之后）；加上此前裂解細胞提取蛋白所需的EP管（通常是一天之內(nèi)進行），因此需要4套EP管；為實驗方便，用于配制梯度稀釋的蛋白樣品的EP管的標記，可以使用簡寫，但操作時需嚴格得從始至終一一對應；05.估算擬加 BCABCA 工作液檢測的孔數(shù)；標準曲線 1616 孔，蛋白樣品每個樣本 2 2 個副孔，共 3 3 個孔；考慮到 BCABCA 工作液的價格，一般預留 10%10%配制;04.01248121620 蛋白標準液體積標準曲線10 倍稀釋2HL士呈口件口口20 倍稀釋1pL樣品06.將上述實驗方案簡單繪制于檢測使用的 9696 孔板上，放在冰上孵育待用；蛋白極易降解，因此實驗操作時，除

22、需佩戴口罩外，全程皆應在冰上進行；有條件時，盛放蛋白樣品的EP管，96孔板要進行提前預冷；07.開始配制標準曲線（蛋白標準品線性稀釋液）以及樣品孔的上樣溶液”；按照匯總配制的原則，標準曲線按 2.52.5 孔體積配制，樣品孔按3.53.5 孔體積配制；配好后，插冰待用；（1）蛋白標準曲線梯度樣品的配制將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20醫(yī)加到96孔板的標準品孔中，力口標準品稀釋液補足到20醫(yī) 相當于標準品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml;蛋白標準品體積（dD01248121620對應蛋白濃度（mg/ml）00.0250.050.10

23、.實際按照2.5個孔匯總配制；單塊96孔板（1根標準曲線）（2.5well）蛋白標準品體積（醫(yī)。01248121620應加蛋白標準品體積（醫(yī)L）02.551020304050應補充蛋白稀釋液體積（醫(yī)L）5047.545403020100兩塊96孔板（2根標準曲線）（Swell）（樣本量較大時）蛋白標準品體積（01248121620P13應加蛋白標準品體積（醫(yī)L）051020406080100應補充蛋白稀釋液體積（醫(yī)L）1009590806040200上述為理想情況；一般實驗時，蛋白樣本量不會太大，同時制作兩根標準曲線也費時費力，一般制作一根即可；如一定要制作兩根標準曲線，則

24、檢測時，一塊96孔板應將全部樣品上樣（比如都上20倍稀釋的樣），如此才可以根據(jù)該標準曲線進行定量（樣品太多跨兩塊96孔板的話，則涉及到使用哪一根標準曲線的問題）；（2）待檢測蛋白樣品的配制稀釋20倍（樣品1L）匯總配方：3.5Lsample+66.5LPBS稀釋10倍（樣品2L）匯總配方：7dLsample+6dLPBS稀釋的目的是因為BCA法測定蛋白濃度有工作范圍”；一般而言，裂解所得的蛋白樣品濃度過高，需進行稀釋方能檢出；常見的稀釋倍數(shù)為10倍,即2dL樣品+18醫(yī)LPBS;但個別情況濃度還較高，為免重復實驗，一般還平行補充一組20倍稀釋的樣本；08.根據(jù)步驟 0505 估算的總孔數(shù)配制

25、BCABCA 工作液；一般以 A A 液體積為準，忽略 B B 液體積；A A 液:B B 液=50:1;=50:1;BCA工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，一般在樣本加入96孔前配制即可；09.將步驟 0707 所配置的各土樣蛋白溶液，按每孔 2020pLpL 的體積加入到對應孔中；96孔板在實驗時容易看錯，操作時應嚴格“唱名”，一一對應；同一樣品同一梯度可不換Tip頭，但吸取不同的土樣蛋白溶液”時則需及時更換Tip頭；止匕外，當移液槍殘留液體較多時，則每加完一上樣孔，需更換Tip頭；先加20口的土樣蛋白溶液”再加200口的BCA工作液看似違背加液體的原則（只能小體積加入大體積），但采取此辦法，一則加樣品時

26、不需要每孔都要換Tip頭，二則節(jié)約更換Tip頭的時間，可以使得各孔內(nèi)BCA反應更均一；操作時，96孔板應始終置于冰上；10.每檢測孔加入 200pLBCAI200pLBCAI 作液;加BCA工作液前，打勻勿忘記；11.將待檢測 9696 孔板放入 37c37c 生化培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育 3030min;min;也可以室溫放置2小時，或60c放置30分鐘；如忘記打開生化培養(yǎng)箱,則放入60c烘箱內(nèi)；BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當延長孵育時間；12.將待檢測 9 96 6 孔板放入酶標儀內(nèi),如實驗室的酶標儀非全

27、波長而又沒有540-595nm之間的其他波長的濾光片進行檢測;蛋白定量（蛋白總量配平）的數(shù)據(jù)處理本次實驗酶標儀檢測結果如下所示:程序：Demo219.12.201611.50.00標準曲線區(qū)域板格式-96孔2。倍稀釋區(qū)域吸光率漉鏡1：完 2納米10 倍稀釋區(qū)域1不34567S9101112A0.1310.1340.1410,】590.190.2070.2250.2470.1470.1480.1560.16B0.1280.134。13901560.1880.2010.222Q.2430.1460.0590.1540.044C0.1350.134013201360.1320.1290.1310.1

28、31013401430.1390.142D0.1350.135013401320.1320.1360.1301301310.140.13S0.142E0.1350.13201320.1340.1320.130.1310.1310.13201390.1410.1-HF0.1420.1430.1410.1320,1390.1380.1320.1470.1380.1530.1510.154G0.1420140.1401380.140.1360.1390.1390.13801520.1560.153H0.1450.143014301420.1+40.140.M0.1420.142015701570.1

29、5601.數(shù)據(jù)區(qū)域劃分待用，并審核是否有異常數(shù)據(jù);562nm562nm 波長處測定 ODOD 值；562nm波長的濾光片，則選取標涯曲線OD值0.1510.1340.1410.1590.190.2070.2250.2470.12B0.H40.1390.1560.1380.2010.2220.243標準曲線OD均值0.12950.1340.140.15750.1890.2040.22350.245如R2值0.99,則本次實驗可信；如R2值V0.99,則根據(jù)情況，剔除不可信值或重復實驗；標準曲線方程的制作|選定數(shù)據(jù)后，“插入”菜單欄里選擇“散點圖”，再選擇僅帶數(shù)據(jù)標記的散點圖;選定上圖中的“數(shù)據(jù)點

30、”后，右鍵選擇“添加趨勢線”國H叼.0E福爵里表格SEJ表格BCA-2016112116無血清譏限L匚M返北賽峭證白Ft&sl取看5油敝二圉特西站亙制圖表rfEjffi住造困谷虧方俏FTig-ml)比砥物藪瓦cone.泳HE帶省國二MHC.（收時睛值不以X軸為度序,atMi示獨立的的刖可慎用該圖.苴31布局公式近施畝間唄溝Acrobar形狀SmarlArt號苜做圉柱F溷折短期語圖條形能Ac1238 值concr(40.12950501340025G0.140.0570.15750.1艮0.1850290.2040.3ID0.22350.4110.2J50.51213141516B3理粒

31、(Eanc.(rne/ml)單欄中選擇“線性”,同時下方的“顯示公式”和“顯示R平方值”兩個02.計算出標準曲線方程待用;OD值cone,(mgml)0.129500.1340.0250.140.050.15750,10.1890.20.2040.30.2454545SOSO+ +;在彈出來的菜選項框也一并勾選;03.計算出樣本的 ODOD 平均值，結合標準曲線分析評估；1計算樣本OD均值之前，要對相關孔的OD值進行初篩，如出現(xiàn)數(shù)值明顯異常的，需提前排除；2樣本OD值一般無特殊情況，數(shù)值不會相差懸殊；OD值需在標準曲線的區(qū)間之間，即不得低于最低值（樣本蛋白質(zhì)濃度太低），高于最高值（樣本蛋白質(zhì)濃

32、度太高，稀釋不夠）；3如進行了雙梯度稀釋，選擇的標準在于，何者更接近標準曲線的中間段；1匹稀釋2。倍0.1350.13404320.1360.1320.1290.1310.1310.134 0,1430.1390,142OD值0J35043504340,1320.1320.B60.130,130.1310.140.1380.1420.135OJ320.1320.1340.1320,130.1310.1310,132 0.1390,1410.141IpLOD均值0.1350.1340.1330.1340,1320.1320310.1310.1320.1410.1390.142標準曲線OD均值范圍

33、0.1295-02452ML稀釋2。倍0.1420.1430.1410.13204390.13804320.1470.138 0.1530.1510.154OD值0.143S0.140.1360.1390.1390.138 0.1520.1560.1530.1450.1430J430,14204420,142 0,1570,1570.1562HL0口均值0.1430.1420.1410.1370.1410.1380.1370.1430.139 0.1540.155Q.1S4出字fist更審息到任就能型m.選解莊正；.彳H3niIIliB0t5!如$45;和蔚3,1)tone*(mg/ml)的兇.S至1.10五正)_招除必生波以年舊5式圖04.確定使用某一稀釋梯度的數(shù)值后，根據(jù)標準曲線方程，得出各樣品的蛋白濃度；本實驗采納稀釋10倍（2L樣品）的數(shù)值；05.確定基準（最小值）濃度，根