正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選補(bǔ)陽(yáng)還五合劑的提取工藝

1、正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選補(bǔ)陽(yáng)還五合劑的提取工藝        【摘要】  目的建立補(bǔ)陽(yáng)還五合劑的提取工藝。方法采用正交實(shí)驗(yàn)的方法，以黃芪甲苷苯甲酰化后產(chǎn)物含量、水提得率和正丁醇萃取部位得率為指標(biāo)，綜合考察每次加水量、總煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)對(duì)提取效果的影響。結(jié)果加水8倍/次，共煮2 h， 2次提取為最佳提取工藝，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了其優(yōu)于正交各方法。結(jié)論 該優(yōu)選出的提取工藝合理。 【關(guān)鍵詞】  補(bǔ)陽(yáng)還五合劑 正交實(shí)驗(yàn) 黃芪甲苷Abstract：ObjectiveTo establish an optimal extr

2、action process for the mixture of Buyang Huanwu. MethodsThe content of Astragalus RP, extractive rate of water and extractive rate of n-butyl alcohol were used as indexes, and orthogonal design was performed to optimize the extraction process. ResultsThe best extraction process was A2B2C2(A：adding w

3、ater volume; B：decocting time C：decocting frequency), and it is the best method by validating. ConclusionThe method is reasonable.Key words： Buyang Huanwu mixture ;   Orthogonal design;   Astragalus RP   補(bǔ)陽(yáng)還五合劑由黃芪、當(dāng)歸等中藥組成，是經(jīng)典名方制劑，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功能。本工藝采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，以黃芪甲苷衍生

4、化產(chǎn)物的含量、水提取得率和正丁醇萃取部位得率為指標(biāo)，綜合考察了每次加水量、總煎煮時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，優(yōu)選出該合劑的提取工藝。1  儀器與試劑高效液相色譜儀，agilent1100，四元泵（G1311A），柱溫箱（G1316A），VWD檢測(cè)器（G1314A），工作站（Chemsstation），agilent手動(dòng)進(jìn)樣器（10 l定量環(huán)）。101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(南通扈通制藥器械設(shè)備廠)；標(biāo)準(zhǔn)品，黃芪甲苷（Astragalus RP  0781-9706）藥品生物制品檢定所提供。所用藥材均購(gòu)于江蘇省藥材公司，并由江蘇省中制劑實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)家鑒定。 吡啶、正丁醇

5、、氫氧化鈉、四氫呋喃、苯甲酰氯、三乙胺均購(gòu)于南京化學(xué)試劑一廠，均為分析純，甲醇為色譜純。標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：精密稱(chēng)取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品7.04 mg，加吡啶溶解定容于10 ml容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為0.704 mg/ml，備用。2  方法與結(jié)果2.1   相關(guān)條件稱(chēng)取黃芪甲苷適量，置容量瓶中，吡啶溶解定容后精密吸取1 ml置容量瓶中，加入2 ml氯仿，吡啶-氯仿（12，V /V），在冰水浴的條件下加入苯甲酰氯0.4 ml。搖勻后置4冰箱中保存24 h，使反應(yīng)完全。取出置蒸發(fā)皿中，在一定條件下?lián)]干有機(jī)溶劑，置空氣中一段時(shí)間后能凝結(jié)，甲醇溶解定容于容量瓶中。2.2 

6、; 正交實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案 選用正交實(shí)驗(yàn)表L9（34），因素設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。3因素分別為：加水倍數(shù)、總提取時(shí)間、提取次數(shù)。3因素3水平共做9組實(shí)驗(yàn)。表1  因素水平（略）2.3  水提取得率精密吸取各樣品溶液適量，相當(dāng)于1 g藥材量，水浴濃縮至浸膏。取出，置105烘箱中5 h，取出，放冷稱(chēng)量，半小時(shí)后再置烘箱中1 h，取出，放冷，稱(chēng)量。2.4  正丁醇萃取部位得率 取相當(dāng)與1 g藥材的各樣品水提液與分液漏斗中加10 ml水飽和的正丁醇萃取，共4次，正丁醇層合并。正丁醇層水浴蒸干，然后置105烘箱5 h后取出，放冷，稱(chēng)量，30 min后再置烘箱中

7、1 h，取出，放冷，稱(chēng)量。2.5  標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取對(duì)照品貯備液1 ml于10ml容量瓶中，處理參照“衍生化反應(yīng)條件”項(xiàng)下進(jìn)行衍生化。衍生化產(chǎn)物用甲醇洗滌并轉(zhuǎn)移、定容于10 ml容量瓶中，再依次精密吸取5ml定容于10 ml容量瓶，對(duì)照品衍生化產(chǎn)物溶液濃度為：0.070 4，0.035 2，0.017 6，0.008 8，0.004 4，0.002 2，0.001 1 mg/ml，上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定。以黃芪甲苷衍生物峰面積對(duì)黃芪甲苷濃度（mg/ml）直線回歸，結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.001 10.070 4 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=75 117X，r

8、=0.999 95。2.6  樣品處理同取各樣品20 ml于分液漏斗中，加水飽和的正丁醇萃取，萃取3次，20 ml/次，正丁醇層合并加1%NaOH洗滌，洗滌3次12 ml/次，再加正丁醇飽和水洗滌，洗滌2次，6 ml/次。正丁醇層水浴蒸干，吡啶溶解定容于5 ml容量瓶中，精密吸取1 ml置容量瓶中，加入2 ml氯仿，在冰浴的條件下加入苯甲酰氯0.4 ml。搖勻后置4冰箱中保存24 h消失，使反應(yīng)完全。取出置蒸發(fā)皿中揮干有機(jī)溶劑，甲醇定容于容量瓶中，即為樣品溶液。1         2.7  黃芪

9、甲苷衍生物含量測(cè)定 按“色譜條件”項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)表2。表2  正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.8  方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)過(guò)權(quán)衡，黃芪甲苷衍生物含量是主要指標(biāo)，水提取得率和正丁醇萃取得率為次要指標(biāo)，設(shè)黃芪甲苷權(quán)重Y=0.7，正丁醇萃取得率權(quán)重Y=0.2，水提取得率Y=0.1，（綜合得分=衍生物含量得分×70%+正丁醇萃取部位得率得分×20%+水提取得率得分×10%）。方差分析表和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，3個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響都不顯著。因素C相對(duì)其他因素影響較大，各因素影響次序?yàn)镃AB；各因素不同水平的影響次序?yàn)锳3A2A1，B2B3B1，C3C2C1，理論

10、最佳提取工藝為A3B2C3，即煎煮3次，加水10倍/次，共煎煮2 h。考慮到從實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性和節(jié)省能源和時(shí)間角度出發(fā)，確定的實(shí)際最佳工藝為：加水8倍/次，共煎煮2 h，煎煮2次。表3  方差分析（略）2.9  驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按最佳提取工藝煎煮與正交實(shí)驗(yàn)等量等比例藥材，所得煎液按前法處理、測(cè)定，得出黃芪甲苷的含量為0.467，高于正交表中各號(hào)實(shí)驗(yàn)得率。3  討論2005版藥典黃芪甲苷的含量測(cè)定是通過(guò)甲醇提取，大孔吸附樹(shù)脂富集，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，目前測(cè)定多用此法25。黃芪中含有多種皂苷、氨基酸、多糖和黃酮類(lèi)成分，這些大多在200 nm左右有吸收的成分對(duì)測(cè)量的干擾，因而

11、選擇蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。但蒸發(fā)光散射法靈敏度較低，而黃芪中黃芪甲苷含量又較低（藥典規(guī)定不得低于0.004%），用大孔樹(shù)脂法來(lái)提高黃芪甲苷相對(duì)含量的方法，富集過(guò)程麻煩，誤差大。用紫外檢測(cè)法靈敏度高，但在選用末端波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定干擾很大。曾嘗試用紫外檢測(cè)器檢測(cè)黃芪甲苷，吸收波長(zhǎng)為203 nm左右，流動(dòng)相為乙腈-水（比例3367；3268；3070；2872不等），用等度洗脫，發(fā)現(xiàn)甲醇溶劑和雜質(zhì)干擾較大，極性相對(duì)黃芪甲苷峰與溶劑峰重合，且回不了基線，在改變流動(dòng)相比例提高流動(dòng)相極性情況下可分離出黃芪甲苷峰，但理論塔板數(shù)低，盡管也有多篇報(bào)道此法可行，但未能重復(fù)；在梯度洗脫情況下，選擇合理的梯度可以將黃芪甲

12、苷和其他雜質(zhì)分開(kāi)，且理論塔板數(shù)高，但分離度不好（<1.5），這對(duì)定量測(cè)定帶來(lái)了誤差，所以也未能建立方法進(jìn)行測(cè)定。如何排除雜質(zhì)的干擾，提高黃芪甲苷的吸收值是解決問(wèn)題的關(guān)鍵，姚美村等1將黃芪甲苷苯甲?；?，在230 nm下檢測(cè)干擾少，吸收值高。依照此方法，取得了滿意的結(jié)果。流動(dòng)相中水對(duì)保留時(shí)間影響非常大，配制時(shí)應(yīng)注意精密吸取，減小誤差。黃芪中黃芪甲苷含量相對(duì)較低，藥典規(guī)定含量應(yīng)不低于0.004%，所以增加了正丁醇萃取部位得率和水提取得率作為指標(biāo)，3個(gè)指標(biāo)綜合考察3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響。提取只是制備工藝的一個(gè)過(guò)程，制劑的制備還包括濃縮精制等過(guò)程，每個(gè)過(guò)程都是相互關(guān)系影響的，所以提取工藝的研究在保證了有效指標(biāo)成分最大程度的提取出的基礎(chǔ)上還要考慮到其他的一系列過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)只研究了補(bǔ)陽(yáng)還五合劑制備提取工藝，其它過(guò)程工藝還有待進(jìn)一步研究。【文獻(xiàn)】  1姚美村，齊 瑩.柱前衍生化法測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的