抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究_圖文

1、抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究王濤,李建東,張全福,李川,劉琴芝,梁米芳3,李德新3(中國(guó)疾病預(yù)防與控制中心病毒病預(yù)防控制所,傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100052摘要:本文報(bào)道在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞漿內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體,研究抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒作用及其抗病毒作用機(jī)理。在獲得穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,用M TT 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗?jié)h坦病毒單鏈抗體對(duì)細(xì)胞增殖的影響,證實(shí)細(xì)胞內(nèi)抗體的表達(dá)不會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同時(shí)間收集病毒感染毒后細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物,用EL ISA 方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外病毒結(jié)構(gòu)蛋白含量的變化,結(jié)果表明定位于

2、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)肉和細(xì)胞漿內(nèi)的抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體均能不同程度降低感染細(xì)胞上清中的核蛋白含量,但是不能或輕微抑制細(xì)胞內(nèi)漢坦病毒核蛋白的合成。利用病毒微量滴定免疫熒光方法,對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗體與病毒的增殖關(guān)系進(jìn)行了研究,證實(shí)無論在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還是在胞質(zhì),抗核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體都能夠抑制病毒的增殖,具有抗病毒活性?？?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體不能抑制病毒結(jié)構(gòu)蛋白的合成,其抗病毒效果是通過抑制病毒的包裝而實(shí)現(xiàn)。關(guān)鍵詞:漢坦病毒;核蛋白;抗病毒;細(xì)胞內(nèi)抗體中圖分類號(hào):R37313+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1000-8721(200602-0089-07收稿日期:2005-09-23;修回日期:2006-01-23基金項(xiàng)

3、目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):30371269作者簡(jiǎn)介:王濤(1972-,中國(guó)疾病預(yù)防與控制中心病毒病預(yù)防控制所博士研究生。漢坦病毒屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬,為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA 病毒,其病毒基因組由L 、和S 三個(gè)片段組成,分別編碼病毒多聚酶、包膜糖蛋白G1、G2和核蛋白。漢坦病毒引起的腎綜合征出血熱主要發(fā)生在我國(guó),臨床病死率較高,至今沒有特異性藥物治療,且抗?jié)h坦病毒感染的機(jī)理研究方面尚存在許多欠缺。因此,抗病毒感染機(jī)理以及新的治療途徑的研究具有理論和實(shí)際意義。細(xì)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá),可與靶分子蛋白或多肽結(jié)合,直接使其失活或影響靶分子蛋白或多肽在細(xì)胞內(nèi)的合成,運(yùn)輸及各種可能的信號(hào)

4、傳導(dǎo),抑制靶分子在細(xì)胞內(nèi)的活性,因而細(xì)胞內(nèi)抗體已成為細(xì)胞內(nèi)蛋白功能、蛋白與蛋白相互作用及信號(hào)傳導(dǎo)等多種功能的一種新工具,并同時(shí)具有臨床治療的應(yīng)用潛力,故細(xì)胞內(nèi)抗體技術(shù)近年來已廣泛用于病毒病、腫瘤治療1,以及心血管疾病、移植及自身免疫疾病2、甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病3等方面的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。為更好地了解漢坦病毒在細(xì)胞內(nèi)的成熟組裝及其病毒結(jié)構(gòu)蛋白在病毒成熟過程中的關(guān)鍵作用和與病毒感染后發(fā)病機(jī)制的關(guān)系,我們構(gòu)建了分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞漿穩(wěn)定表達(dá)的抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系,感染漢坦病毒后研究其抗病毒作用,為研究漢坦病毒感染的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。材料與方法1載體與細(xì)胞質(zhì)粒pOPE -101-215(Y

5、ol 為單鏈抗體表達(dá)構(gòu)建載體,具有pelB 分泌信號(hào)序列及3個(gè)標(biāo)簽基因:Y ol 2Epitope 為EEGEFSEAR 9個(gè)氨基酸殘基的Linker 序列、c 2myc Epitope 和6個(gè)組氨酸標(biāo)簽,德國(guó)海德堡大學(xué)Stefan D übel 教授惠贈(zèng)。真核表達(dá)載體p EF/myc/ER 和p EF/myc/cyto 購(gòu)自Invitrogen 公司,為EF 21啟動(dòng)子攜帶c 2myc 2Epi 2tope 。其中p EF/myc/cyto 多克隆位點(diǎn)N 端沒有分泌及定位信號(hào)N 2端以蛋氨酸起始,蛋白合成后分布于細(xì)胞漿中,p EF/myc/ER 多克隆位點(diǎn)N 端有定位ER 信號(hào)肽,

6、C 端具有ER滯留信號(hào)肽SEK DEL ,克隆基因表達(dá)后將定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Vero 2E6細(xì)胞由美國(guó)A TCC 引進(jìn),本實(shí)驗(yàn)室保存,使用代次為1230代。營(yíng)養(yǎng)液為含有10%小牛血清的DMEM 液,維持液為含2%小牛血清DMEM 液。瞬時(shí)表達(dá)用COS 27細(xì)胞由美國(guó)A TCC 引進(jìn)本室保存,營(yíng)養(yǎng)液為10%小牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液。E 1coli XL12blue ,由本室保存,E 1coli DH5,由本室保存1抗?jié)h坦病毒核蛋白單鏈抗體表達(dá)載體pOPE1012L13F3scFv 和pOPE1012H34scFv 本室構(gòu)建并保存4。2試劑實(shí)驗(yàn)用酶購(gòu)自Biolabs 、Takara 和GIBCO

7、 公司;L IPOFECTAMIN E K it (GIBCO BRL 。FITC 標(biāo)記抗鼠IgG Fab 特異性抗體,FITC 標(biāo)記抗人IgG Fab 特異性抗體,TRITC 標(biāo)記抗鼠IgGHRP 酶標(biāo)抗人IgG Fab 特異性抗體,第22卷第2期2006年3月病毒學(xué)報(bào)CHIN ESE JOURNAL OF VIROLO GY Vol.22No.2March 2006HRP酶標(biāo)抗鼠IgG Fab特異性抗體,HRP酶標(biāo)抗出血熱抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？故骯nti2myc單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrigen公司。全病毒感染Vero2E6細(xì)胞制備的抗原片和漢坦病毒核蛋白抗原由本室自制并保存。

8、3細(xì)胞內(nèi)抗體表達(dá)載體的構(gòu)建及其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)311單鏈抗體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)抗體基因來自鼠源漢坦病毒核蛋白組特異性抗體L13F3和人源漢坦病毒型特異性抗體H345。ER2scFv N端有ER信號(hào)肽,C端具有ER滯留信號(hào)肽SEK DEL,scFvs表達(dá)后將定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。PCR擴(kuò)增單鏈抗體基因,分別以52A GG TCC A GC TGC TCG A GT CTGG23,52G A G GTG CA G CTG CTC G A G TCT GGG23為正向引物,單鏈抗體K appa鏈可變區(qū)3端引物為反向引物分別擴(kuò)增鼠源L13F3scFv和人源H34scFv。PCR產(chǎn)物經(jīng)Xho I和Not

9、I酶切克隆入p EF/myc/ ER載體,命名為p EF/myc/ER/L13F3和p EF/myc/ER/ H34,相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)抗體命名為:L13F32ER和H342ER。cy2 to2scFv沒有分泌及定位信號(hào),N2端以蛋氨酸起始,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的scFv將分布于細(xì)胞質(zhì)中,選擇Nco I和Not I作為scFv克隆進(jìn)入位點(diǎn),可由pOPE1012scFv原核表達(dá)載體經(jīng)Nco I和Not I酶切消化后直接克隆進(jìn)入p EF/myc/cyto載體,命名為p EF/myc/cyto/L13F3,p EF/myc/cyto/H34,相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)抗體命名為:L13F32Cyto,H342Cyto。312細(xì)

10、胞內(nèi)抗體在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)4種載體L IPO2 FECTAMIN E2000法轉(zhuǎn)染24孔板中COS27細(xì)胞(操作方法按K it說明書,48h后消化細(xì)胞,制備抗原片。IFA檢測(cè)單鏈抗體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),加鼠anti2myc單克隆抗體,37孵育后加熒光素FITC標(biāo)記抗鼠IgG Fab特異性抗體,熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察抗體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系的建立質(zhì)粒p EF/myc/cy2 to/AH100,p EF/myc/cyto/Y5,p EF/myc/ER/AH100和p EF/myc/ER/Y5L IPOFECTAMIN E2000法分別轉(zhuǎn)染24孔板中Vero2E6細(xì)胞,24h

11、后轉(zhuǎn)種于T25方瓶。24h后,加入終濃度為300g/ml的G418,37,5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中逐漸加大G418至終濃度為1000g/ml,且細(xì)胞長(zhǎng)滿T25方瓶。胰酶消化細(xì)胞,10-510-6稀釋細(xì)胞,轉(zhuǎn)種于96孔板,有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆,建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系。制備細(xì)胞抗原片,激光共聚焦顯微鏡觀察抗體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。5MTT法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的細(xì)胞活力基本按文獻(xiàn)6進(jìn)行:以每孔103104個(gè)細(xì)胞接種Vero2E6細(xì)胞和上述所建細(xì)胞系于96孔板,每孔體積200l,每種細(xì)胞8孔,共傳4塊板,將培養(yǎng)板移入CO2孵箱,37,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。從第3d開始,每天取一塊培養(yǎng)板,每孔

12、加入M TT溶液(5mg/ml20l,37,繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng),小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清,每孔加入150l DMSO,震蕩10min,使結(jié)晶充分溶解。測(cè)定各孔490nm波長(zhǎng)時(shí)光吸收值,記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸,光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。6漢坦病毒染毒實(shí)驗(yàn)將穩(wěn)定表達(dá)scFv2cyto和scFv2ER 的Vero2E6細(xì)胞系在無G418的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后,無血清DMEM培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞3遍,去掉死細(xì)胞。漢坦病毒762118以每個(gè)細(xì)胞011PFU病毒(011MOI感染細(xì)胞,正常Vero2E6細(xì)胞設(shè)為對(duì)照。在37吸附2h,每15 20min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶,以使病毒吸附均勻。用含2

13、%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將每瓶細(xì)胞沖洗2遍,然后每瓶補(bǔ)加DMEM維持液維持培養(yǎng)細(xì)胞。7漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)及其在V ero2E6細(xì)胞中產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)觀察711漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白的獲得7每天收獲病毒感染的Vero2E6細(xì)胞培養(yǎng)液,-70凍存待用;收獲的感染細(xì)胞,棄上清。預(yù)冷的PBS洗2遍。加入含015%去氧膽酸鈉和011% NP240以及蛋白酶抑制劑的pH715的T ris2HCl裂解緩沖液, 4使細(xì)胞充分裂解。將裂解液移入離心管,4,13000r/min 離心15min。收集的上清即含有病毒結(jié)構(gòu)蛋白。712EL ISA夾心法檢測(cè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白動(dòng)態(tài)變化培養(yǎng)上清中病毒N蛋白動(dòng)態(tài)變化:鼠源抗?jié)h坦病毒核蛋

14、白抗體L13F3包被,37封閉1h,加入病毒感染Vero2E6不同天數(shù)收獲的上清,37反應(yīng)1h。PBS2T清洗5遍,加入11000稀釋于5%脫脂奶的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗?jié)h坦病毒N蛋白單克隆抗體,37反應(yīng)1h。顯色10min,2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。標(biāo)檢測(cè)儀波長(zhǎng)490nm測(cè)定每孔的吸光度A值,未染毒的空白Vero2E6細(xì)胞上清為對(duì)照調(diào)零。感染細(xì)胞中病毒N 蛋白動(dòng)態(tài)變化:單克隆抗體L13F3包被,加入不同天數(shù)收獲的感染細(xì)胞裂解物,檢測(cè)同上。培養(yǎng)上清中病毒糖蛋白動(dòng)態(tài)變化:單克隆抗體H13211E102121包被,加入不同天數(shù)收獲的細(xì)胞培養(yǎng)上清,371h。加入1:10稀釋于5%脫脂奶的人源

15、抗?jié)h坦病毒糖蛋白單克隆抗體Y22,37反應(yīng)1h,辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人Fab特異性抗體顯色。波長(zhǎng)490nm 測(cè)吸光度。感染細(xì)胞中病毒糖蛋白動(dòng)態(tài)變化:單克隆抗體H13211E102121以1:500包被,加入不同天數(shù)收集的感染細(xì)胞裂解物,檢測(cè)同上。8微量法滴定病毒8使Vero2E6細(xì)胞在96孔板長(zhǎng)成單層。將58d收獲的病毒上清用維持液做10-110-8稀釋,接種于上述96孔板,每稀釋度4孔,每孔011ml。置37,5%CO2培養(yǎng)8d,中間換液1次。將各孔細(xì)胞涂片,I2 FA T法檢測(cè),計(jì)算不同樣品TCID50。結(jié)果1細(xì)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)細(xì)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS27細(xì)

16、胞都能見到目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的特異性熒光,其中抗體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布呈現(xiàn)類似梭狀熒光,而細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)的熒光則近似指環(huán)狀,與文獻(xiàn)報(bào)道一致9,顯示目的抗體能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)定位表達(dá)(圖1。9病毒學(xué)報(bào)22卷 圖1細(xì)胞內(nèi)抗體在COS -7細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)免疫熒光定位Figure 1Immunofluorescence localization of intracellular antibodies transientl y expressed in transfected COS 27cell1.L13F32Cyto ;2.L13F32ER ;3.H342Cyto ;4.H342ER.2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞內(nèi)抗體

17、細(xì)胞系的建立四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Vero 2E6細(xì)胞經(jīng)G418及有限稀釋法篩選,G418(750g/ml 維持,能見到目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的特異性熒光,其陽性率大于95%,表明建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系(圖2 。圖2細(xì)胞內(nèi)抗體在Vero 2E6細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)免疫熒光定位 Figure 2Immuofluorescence localization of intracellular antibodies stably expressed in Vero 2E6cell line1.L13F32Cyto ;2.L13F32ER ;3.H342Cyto ;4.Vero 2E6control.3細(xì)胞內(nèi)

18、表達(dá)單鏈抗體對(duì)細(xì)胞活力的影響活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的MTT 還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物(Formazan 并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜DMSO 能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm 波長(zhǎng)測(cè)定其光吸收值,可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。通過MTT 法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系的增殖活力,Vero 2E6細(xì)胞為對(duì)照。結(jié)果顯示表達(dá)單鏈抗體的細(xì)胞系與對(duì)照細(xì)胞之間的增殖活力差別較小(結(jié)果未顯示詳細(xì)的數(shù)據(jù)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。4抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白合成的影響為了檢測(cè)抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體是否具有抗病毒感染活性,我

19、們用漢灘病毒(HTN 762118感染上述所建立的細(xì)胞系,通過夾心E L ISA 檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)上清病毒結(jié)構(gòu)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。用011感染復(fù)數(shù)(MOI 漢灘病毒762118感染表達(dá)抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系,在第1天就能夠在上清中檢測(cè)到病毒核蛋白。感染后第3天換液,從第4天開始收集上清并檢測(cè)。結(jié)果顯示圖3:作為對(duì)照的感染漢坦病毒762118株Vero 2E6細(xì)胞上清中的漢坦病毒762118N 蛋白在第6d 達(dá)到高峰,其后2d ,N 蛋白的變化基本維持在同一水平。所建立的穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系都能抑制上清中漢灘病毒N 蛋白的產(chǎn)生,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)表達(dá)的抗N 蛋白組特異性抗體L13F3

20、2ER 的抑制效果最好,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)表達(dá)的抗N 蛋白HTN 型特異性抗體H342ER 效果較差。這種抑制是否為特異性作用,即細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗?jié)h灘病毒抗體是否直接與抗原作用產(chǎn)生上述抑制;或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗體影響細(xì)胞生長(zhǎng)或狀態(tài)導(dǎo)致病毒的復(fù)制受到影響,從而產(chǎn)生上述抑制。我們用漢城型(SEO 病毒L99以011MO I 感染抗?jié)h坦病毒核蛋白抗體細(xì)胞系,檢測(cè)收集的病毒培養(yǎng)上清。如圖4所示,型特異性抗體H342scFv 無論在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER 還是在胞質(zhì)(Cyto 中表達(dá)都不能影響上清中N 蛋白的產(chǎn)生;而組特異性抗體L13F3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)中都能抑制病毒培養(yǎng)液中N 蛋白的含量。第9d N 蛋白含量的下降應(yīng)歸因于培養(yǎng)

21、細(xì)胞的脫落。證明細(xì)胞內(nèi)抗體與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。192期王濤等:抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究 圖3EL ISA 夾心法檢測(cè)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系上清中漢坦病毒762118核蛋白的動(dòng)態(tài)變化Figure 3Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain 762118in infected cell line culture stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleocapsid protein intracellular antibodies (by EL ISA 圖4EL IS

22、A 夾心法檢測(cè)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系上清中漢坦病毒L99核蛋白的動(dòng)態(tài)變化Figure 4Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain L99in infected cell line culture stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleocapsid protein intracellular antibodies (by EL ISA 用011MO I 762118病毒感染所建立的細(xì)胞系,細(xì)胞內(nèi)病毒核蛋白變化結(jié)果如圖5所示:在作為對(duì)照的Vero 2E6細(xì)胞中,N 蛋白含量依然在第四

23、天達(dá)到高峰,并維持在幾乎同一水平 ?？?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系中L13F32ER ,H342ER 對(duì)N 蛋白復(fù)制的抑制作用很弱,而L13F32Cyto 和H342Cy 2to 幾乎不能抑制N 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生和積累。圖5EL ISA 檢測(cè)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系細(xì)胞裂解液中漢坦病毒762118核蛋白的動(dòng)態(tài)變化Figure 5Dynamic changes of the N protein of HTN virus strain 762118in infected cell line lysates stablyexpressing anti 2Hantavirus nucleo

24、capsid protein intracellular antibodies (0.1MOI ,by EL ISA 病毒培養(yǎng)液中糖蛋白含量較低,上清中幾乎無法檢測(cè)。而細(xì)胞內(nèi)糖蛋白含量顯著高于病毒培養(yǎng)液中的含量,在細(xì)胞裂解液中可檢測(cè)出糖蛋白的積聚。作為對(duì)照,糖蛋白在Vero 2E6細(xì)胞中的含量基本處于上升趨勢(shì),結(jié)果如圖6,表達(dá)漢坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系對(duì)病毒糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制抑制29病毒學(xué)報(bào)22卷不明顯 。圖6EL ISA 檢測(cè)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系細(xì)胞裂解液中漢坦病毒762118糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化Figure 6Dynamic changes of the glycoprot

25、ein of HTN virusstrain 762118in infected cell lysates stably expressing anti 2Hantavirus nucleocapsid proteinintracellular antibodies (0.1MOI ,by EL ISA 5抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒活性的檢測(cè)為進(jìn)一步明證明病毒增殖與細(xì)胞內(nèi)抗體之間的關(guān)系,對(duì)病毒培養(yǎng)液中的病毒含量用免疫熒光法(IFA 進(jìn)行了滴定。如圖7所示,作為對(duì)照的Vero 2圖7熒光微量分析法滴定表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系培養(yǎng)上清中病毒滴度Figure 7Detection of

26、 the titers of HTN virus strain 762118in infected cell line culture su pernatant stably expressing anti 2Hantavirus nucleocapsid proteinintracellular antibodies (by IFA E6細(xì)胞,其病毒感染后第1d 收獲的上清即具有感染力,表明已有病毒包裝、成熟、釋放。而此時(shí)從4種細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系收獲的上清都不具有感染性,沒有成熟的病毒產(chǎn)生。病毒滴度在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì),至第8d ,TCID 50可達(dá)到106-7/011ml 。

27、與上述糖蛋白產(chǎn)生高峰相吻合。所有表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞系在第5d 和第8d ,其上清中病毒滴度都顯著低于Vero 2E6細(xì)胞,表明抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體能夠部分抑制病毒的復(fù)制,具有抗病毒作用。其中,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的組特異性抗體L13F32ER 抗病毒活性最強(qiáng)。討論細(xì)胞內(nèi)抗體是一類在細(xì)胞內(nèi)定位表達(dá),并發(fā)揮作用的新型基因治療抗體。通過研究細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)HIV -1結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和酶蛋白的作用,證實(shí)它能抑制HIV 早期和晚期復(fù)制10,11。為了研究漢坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體的抗病毒作用,漢坦病毒的結(jié)構(gòu)蛋白被選擇為細(xì)胞內(nèi)抗體作用的靶分子。本實(shí)驗(yàn)選擇鼠源抗?jié)h坦病毒組特異性抗體L13F3和人源抗?jié)h

28、坦病毒型特異性抗體H34,作為細(xì)胞內(nèi)抗體的源抗體,研究抗體與病毒蛋白的相互作用和細(xì)胞內(nèi)的抗病毒活性。通過M TT 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗?jié)h坦病毒單鏈抗體對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性極小,并未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和表型的損害。這意味著,此文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)生是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗體直接與漢坦病毒相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白作用的結(jié)果,而不是通過影響細(xì)胞的生長(zhǎng)而對(duì)病毒在細(xì)胞中的生命過程產(chǎn)生的間接影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于Vero 2E6細(xì)胞,所建立的在胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系都能抑制上清中漢坦病毒N 蛋白的產(chǎn)生。上清中的N 蛋白與病毒的成熟、釋放密切相關(guān),是上清中病

29、毒量的標(biāo)志之一。穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系培養(yǎng)上清中的N 蛋白的產(chǎn)生受到抑制,說明成熟、釋放的病毒量少于正常Vero 2E6細(xì)胞。經(jīng)典理論認(rèn)為N 蛋白是胞質(zhì)蛋白,在病毒的裝配過程中N 蛋白的首要功能是與病毒基因組RNA 結(jié)合形成核酸核蛋白,保護(hù)病毒RNA 免受核酸酶的降解12vRNA 和cRNA 在通過RdRp 復(fù)制過程中都需與N 蛋白衣殼化才能完成13,同時(shí)N 蛋白還可能調(diào)控病毒的復(fù)制周期14,在病毒的裝配過程中也發(fā)揮著重要作用15。定位于胞質(zhì)的L13F32Cyto ,H342Cyto 在胞質(zhì)與N 蛋白結(jié)合,干擾N 蛋白與vRNA 的結(jié)合及普馬拉病毒N 蛋白的羧基端93個(gè)氨基酸16

30、,H34為型特異性抗體,其作用位點(diǎn)位于C 2端50aa ,可能抑制N 蛋白與RNA 結(jié)合。N 蛋白可能直接和G1的細(xì)胞漿尾直接作用,起始病毒裝配的發(fā)生17,L13F32Cyto ,H342Cyto 也可能干擾N 蛋白與G1間的相互作用,阻止病毒的裝配。型特異性抗體H342scFv 無論在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER 還是在胞質(zhì)(Cyto 中表達(dá)都不能影響上清中漢城病毒392期王濤等:抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體抗病毒作用的研究94 病 毒 學(xué) 報(bào) 22 卷 2 Jones S D , Marasco W A. Antibodies for targeted gene t herapy : extracellul

31、ar gene targeting and intracellular expression J . Ad2 vanced Drug Delivery Review , 1998 , 31 : 153 - 170. 3 Lecerf J M , Shirley T L , Zhu Q. Human single2chain Fv intrabod2 ies counteract i n sit u huntington aggregation in cellular models of Huntington s disease J . Proc Natl Acad Sci USA , 2001

32、 , 98 : 4764 - 4769. 4 李建東 , 王濤 , 梁米芳 , 等 . 抗?jié)h坦病毒核蛋白單鏈抗體的構(gòu)建 ( SEOV L99 株 N 蛋白的產(chǎn)生 ; 而組特異性抗體 L13 F3 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)中都能抑制病毒培養(yǎng)液中 L99 株 N 蛋白的含量 。證明抗病毒效果是由細(xì)胞 內(nèi)抗體與相應(yīng)抗原特異性相互作用所導(dǎo)致 。由于傳 統(tǒng)理論認(rèn)為漢坦病毒 N 蛋白不進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ,則定位 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的 L13 F32ER , H342ER 抗病毒效果明顯 ,N 蛋白能夠與在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)定位表達(dá)的 scFv 共定位 ,實(shí) 驗(yàn)結(jié)果證實(shí)這不是由于細(xì)胞固定和染色所造成的假 象 ,這是傳統(tǒng)理論無法解釋 ( 另文發(fā)

33、表 。布尼亞病 毒科中 Uukuniemi ( U U K 病毒已明確是在高爾基 體內(nèi)成熟 , 其 N 蛋白也在高爾基體聚集 18 , H TNV 是否也有類似機(jī)制 ,尚未明了 ,我們將在今后對(duì)其現(xiàn) 象和機(jī)理進(jìn)行探討 。 病毒糖蛋白在上清中無法檢測(cè) , 表明在病毒培 養(yǎng)液中糖蛋白含量較低 ; 而細(xì)胞內(nèi)糖蛋白含量顯著 高于病毒培養(yǎng)液中的含量 , 在細(xì)胞裂解液中可檢測(cè) 出糖蛋白的積聚 , 這與文獻(xiàn)報(bào)道一致 8 。作為對(duì) 照 ,糖蛋白在 Vero2E6 中的含量基本處于上升趨勢(shì) , 表達(dá)漢坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系不能抑制 病毒糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制 。 所有表達(dá)抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞

34、系在第 5d 和第 8d , 其上清中病毒滴度都顯著低于 Vero2E6 細(xì)胞 , 表明抗?jié)h坦病毒核蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體 同樣能夠部分抑制病毒的復(fù)制 , 具有抗病毒作用 。 其中 ,組特異性抗體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)的 L13 F32scFv2 ER 抗病毒活性最強(qiáng) 。 綜上所述 , 該文構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)抗?jié)h坦病毒 N 蛋白細(xì)胞內(nèi)抗體的細(xì)胞系具有抗病毒活性 , 證實(shí)細(xì) 胞內(nèi)抗體在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與病毒蛋白結(jié)合 。抗 N 蛋 白細(xì)胞內(nèi)抗體對(duì) N 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成作用明顯 , 其抗病毒效應(yīng)可能通過抑制病毒的包裝和釋放而實(shí) 現(xiàn) 。研究結(jié)果同時(shí)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的抗?jié)h坦病毒細(xì) 胞內(nèi)抗體具有明顯的抗病毒功能 , 對(duì)目前公認(rèn)的核

35、 蛋白在胞漿合成極其相應(yīng)病毒組裝機(jī)理提出挑戰(zhàn) , 病毒核蛋白有可能同時(shí)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成或通過某種 機(jī)制進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 。 參考文獻(xiàn) : 1 Deshane J , Cabrera C , Curiel D T , et al. Targeted eradication of ovarian cancer mediated by intracellular expression of anti2etbB22 single2chain antibodyJ . Gynecol Oncol , 1995 , 59 : 8 - 14. 與表達(dá) J . 病毒學(xué)報(bào) , 2003 , 19 : 118 - 122.

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43、bodies to Nucleocapsid Protein of H an2 tavirus WAN G Tao , L I Jian2dong , ZHAN G Quan2f u , L I Chuan , L IU Qing2zhi , L I De2xin , L IAN G Mi2fang ( S tate Key L aboratory f or I nf ectious Disease Prevention and Cont rol N ational I nstit ute f or V i ral Disease Cont rol and Prevention , Chi n

44、ese Center f or Disease Cont rol and Prevention , Beiji ng 100052 , Chi na Abstract :In t his st udy , we have investigated t he potential f unctions of Hantavirus nuclecapsid ( N protein in Hantavirus replication , assembly and mat uration by expression of t he int racellular antibodies to Hantavirus nu2 cleocaps