淺論蝦青素對(duì)小鼠急性乙醇肝損傷的保護(hù)作用

1、淺論蝦青素對(duì)小鼠急性乙醇肝損傷的保護(hù)作用         【摘要】  目的： 研究蝦青素對(duì)乙醇所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。方法： 雄性小鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、急性乙醇肝損傷模型組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組(15 mg/kg)以及蝦青素低、中、高劑量組(10，15,20 mg/kg)共6組。測(cè)定并比較各組小鼠肝臟系數(shù)，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHpx）活性與丙二醛(MDA)含量；測(cè)定肝組織中SOD,GSHpx

2、活性,MDA含量以及組織病理系數(shù)。結(jié)果： 各劑量蝦青素均能升高急性乙醇肝損傷小鼠血清與肝組織中SOD,GSHpx活性(P0.01)，降低血清ALT,AST活性(P0.01)，降低血清與肝組織MDA含量(P0.01)，并能不同程度地改善肝臟病理組織損傷。結(jié)論： 蝦青素對(duì)乙醇所致急性肝損傷具有預(yù)防性保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】  蝦青素； 乙醇肝損傷； 抗氧化Abstract  Objective: To study the protective effects of astaxanthin against the acute alcohol liver injury in mice

3、 and research its possible mechanism for offering scientific basis of its health function. Methods： Randomly to distribute 60 male  mices to control group, acute alcohol liver injury model group, DDB group(15 mg/kg) and low, middle, high dose group s of astaxanthin(10, 15, 20 mg/kg), and to det

4、ermine and compare liver index between groups, with serum alanine transaminase(ALT),aspartate transaminase(AST),superoxide dismutase(SOD),glutathione perioxidase(GSHpx) activities,malondialdehyde(MDA) content, liver SOD,GSHpx activities,MDA content and liver tissue pathology index to be assayed.

5、0; Results： Treatment with different dose astaxanthin could significantly increase serum and liver tissue SOD,GSHpx activities(P0.01), decrease serum ALT,AST levels(P0.01) and MDA content in liver tissue(P0.01). Pathology index  showed that astaxanthin could ameliorate the liver injury in diffe

6、rent degree.  Conclusion： Astaxanthin showed protective effects on the acute alcohol liver injury induced by alcohol in mice.Key words  astaxanthin;  alcohol liver injury;  antioxidant乙醇性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指由于乙醇攝入過(guò)量而導(dǎo)致的肝臟一系列損害病變。肝臟中過(guò)量的乙醇及其氧化代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)肝細(xì)胞微粒體酶細(xì)胞色素

7、P450系統(tǒng)活性，特別是與乙醇代謝有關(guān)的高活性氧化代謝酶CYP2E1活性升高，進(jìn)而通過(guò)CYP2E1的氧化代謝產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS具有極強(qiáng)的氧化攻擊特性，可直接攻擊細(xì)胞器、DNA及具有重要功能的蛋白信號(hào)因子，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及肝功能異常等1。   蝦青素是一種類(lèi)胡蘿卜素，主要以全反式異構(gòu)體形式存在于海洋動(dòng)物體、藻體及多數(shù)陸生植物體內(nèi)并具有多種生物學(xué)功能，如抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌等作用，其中總抗氧化能力為維生素E的近20倍2。   隨著蝦青素消費(fèi)市場(chǎng)的不斷擴(kuò)展，國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)開(kāi)

8、始集中圍繞其預(yù)防與治療疾病潛在機(jī)理進(jìn)行探索性研究，目前尚未見(jiàn)有關(guān)蝦青素對(duì)急性乙醇肝損傷影響的報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)就這一問(wèn)題進(jìn)行了初步的研究工作。   1  材料與方法1.1  主要儀器和試劑   Labconco冰凍真空干燥儀（法國(guó)樂(lè)高公司）,752分光光度計(jì),AE100電子天平（中國(guó)伯樂(lè)公司），電熱三用水箱,KA1000型臺(tái)式離心機(jī)（中國(guó)杭州華亭公司），960型熒光分光光度計(jì),J2SH高速冰凍離心機(jī)（日本島津公司），C30柱（YMC Carotenoid S5，Waters），HPLC（Waters 600E溶劑輸送系統(tǒng)，PDA2996

9、二極管陣列檢測(cè)器Waters），聯(lián)苯雙酯（北京協(xié)和制藥廠），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSHpx）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），全反式蝦青素乳化顆粒（瑞士羅氏DMS公司），乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）（美國(guó)迪馬公司），無(wú)水乙醇（北京化學(xué)試劑公司），大孔吸附樹(shù)脂（天津農(nóng)業(yè)股份公司）。   1.2  乳化劑破乳制備蝦青素1.3  蝦青素鑒定   參照全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)其HPLC中保留時(shí)間和紫外可見(jiàn)吸收光譜的特征峰進(jìn)行鑒定。

10、得到的蝦青素提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾后用高效液相色譜分離。色譜柱：Waters YMC Carotenoid S5(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇（7525）;流動(dòng)相B：MTBE；流動(dòng)相A與B中分別加入0.05%三乙胺作為改性劑防止蝦青素降解；線(xiàn)性梯度洗脫：B在8 min內(nèi)由0%增加至55%；835 min B維持55%；3540 min B由55%減至0%；流速1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)： /nm=475；波長(zhǎng)范圍260700 nm；進(jìn)樣量20 l。收集后觀察其光譜特征峰行為3。色譜和光譜分析結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用灌胃物為全反式蝦青素，純度為95%。1.4  動(dòng)物

11、實(shí)驗(yàn)2  結(jié)果2.1  各組小鼠血中相關(guān)生化指標(biāo)及肝重系數(shù)    與正常對(duì)照組比較，急性乙醇肝損傷模型組小鼠血中SOD,GSHpx活性顯著降低(P0.01)，而ALT,AST活性,MDA含量和肝重系數(shù)顯著增加(P0.01)。與急性乙醇肝損傷模型組比較，蝦青素各劑量組和聯(lián)苯雙酯組血中SOD,GSHpx活性明顯升高，ALT,AST活性,MDA含量和肝重系數(shù)明顯降低(P0.01)。與蝦青素低劑量組比較，蝦青素中、高劑量組SOD,GSHpx活性升高(P0.01)，ALT,AST活性,MDA含量和肝重系數(shù)降低(P0.01)。與中劑量組比較，蝦青素高劑量組SOD,G

12、SHpx活性升高(P0.01)，ALT,AST活性和MDA含量降低(P0.01)，顯示出一定的劑量反應(yīng)關(guān)系（表1）。         2.2  各組小鼠肝臟相關(guān)生化指標(biāo)及組織脂肪變性評(píng)分   與正常對(duì)照組比較，急性乙醇肝損傷模型組小鼠肝臟SOD,GSHpx活性顯著降低(P0.01)，而MDA含量顯著增加(P0.01)。與急性乙醇肝損傷模型組比較，蝦青素各劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠肝臟組織中SOD,GSHpx活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P0.01)。與蝦青素低劑量組比較，蝦青素中、高劑

13、量組SOD,GSHpx活性升高(P0.01)，MDA含量降低(P0.01);與中劑量組比較，蝦青素高劑量組SOD,GSHpx活性升高(P0.01)，MDA含量降低(P0.01)，顯示出一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。此外，蝦青素各劑量組小鼠肝臟病理組織檢查評(píng)分均明顯低于急性乙醇肝損傷模型組(P0.01)，見(jiàn)圖1。   表1  各組小鼠血清中SOD, GSHpx, ALT, AST活性和MDA含量（略）Tab 1  SOD,GSHpx, ALT, AST activity and MDA content in mice seruma: P0.01,與對(duì)照組相比；b:P

14、0.01, 與模型組相比；c:P0.01,與聯(lián)苯雙酯組相比；d:P0.01，與低劑量組相比；e:P0.01, 與中劑量組相比   表2  各組小鼠肝臟組織中SOD,GSHpx活性,MDA含量和病理組織脂肪變性評(píng)分（略）Tab 2  SOD,GSHpx activity, MDA content and pathology index in mice livera:P0.01, 與對(duì)照組相比；b：P0.01，與模型組相比； c：P0.01，與聯(lián)苯雙酯組相比； d：P0.01，與低劑量組相比；e：P0.01，與中劑量組相比   3

15、0; 討論   各種有害因素所致的肝損傷可表現(xiàn)為肝壞死、脂肪肝、膽汁淤積、肝纖維化、肝硬化及肝癌等，對(duì)肝損傷的防治目前仍是一個(gè)全球性的嚴(yán)峻課題。因此通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型，研究肝病的發(fā)生機(jī)制，篩選保肝藥物，探索保肝作用原理，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。乙醇對(duì)肝損傷的毒性作用是通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用進(jìn)行的。乙醇在代謝中激活的氧自由基，可與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，也可使肝細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而損傷肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死4-6。    乙醇氧化產(chǎn)生的乙醛具有毒性作用，可抑制烷基化核蛋白的修復(fù)，降低肝酶的活

16、性；同時(shí)，乙醇的長(zhǎng)期攝入顯著降低了線(xiàn)粒體的氧利用率。反過(guò)來(lái)，線(xiàn)粒體氧化容量的受損也會(huì)干擾乙醛的氧化，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致乙醛逐漸累積并加重線(xiàn)粒體的損傷。而且，乙醛可以減少還原型谷胱甘肽(GSH)的濃度，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增加自由基的毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。乙醛結(jié)合微管上的微管蛋白，阻礙蛋白質(zhì)的分泌，形成的乙醛-蛋白促使膠原產(chǎn)生，可以作為腫瘤抗原，刺激免疫反應(yīng)發(fā)揮作用，誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生。此外有研究顯示，乙醇可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF)的產(chǎn)生，從而刺激了肝星狀細(xì)胞的膠原合成，促進(jìn)肝臟纖維化的進(jìn)展7-9。   當(dāng)機(jī)體攝入乙醇時(shí)，可以顯著影響血清ALT,AST活性。同時(shí)

17、體內(nèi)肝組織細(xì)胞中的自由基代謝平衡就會(huì)失調(diào)，對(duì)自由基的防御能力也會(huì)下降，過(guò)量自由基可使生物膜脂質(zhì)雙分子層中的不飽和脂肪酸過(guò)氧化，而形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，從而使膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生障礙。過(guò)氧化脂質(zhì)的代謝產(chǎn)物MDA進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無(wú)活性脂褐質(zhì)，沉積于組織細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法維持正常代謝而死亡10。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與模型組比較，蝦青素各劑量組血清與肝臟組織中MDA含量均明顯減少，說(shuō)明蝦青素可以促使乙醇所致急性肝損傷模型小鼠MDA含量的升高。   SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶之一，乙醇的攝入使其活性減弱，引起不飽和脂肪酸氧化生成過(guò)氧化物，

18、形成脂褐質(zhì)，過(guò)氧化物可使DNA、蛋白質(zhì)和酶等改變、破壞，從而加速肝臟損傷11。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，蝦青素各劑量組小鼠血清與肝臟組織中SOD活性均明顯增強(qiáng)。由此可推斷蝦青素可以抑制乙醇所致急性肝損傷模型小鼠SOD活性的降低。GSHpx是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，可通過(guò)特異性催化GSH對(duì)氫化氧化物的還原反應(yīng)，而消除細(xì)胞內(nèi)有害的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，以阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，從而對(duì)保護(hù)細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行起到重要作用。隨著機(jī)體乙醇攝入的增多，體內(nèi)自由基水平的不斷增加，GSHpx的活性會(huì)降低12。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，蝦青素各劑量組小鼠血清與肝臟組織中GSHpx活性均明顯增強(qiáng)。由此可

19、推斷蝦青素可抑制乙醇所致急性肝損傷模型小鼠GSHpx活性的降低。   綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蝦青素可以降低血清ALT,AST活性和肝臟組織中MDA含量，升高血清與肝組織中SOD,GSHpx活性，并降低肝細(xì)胞脂肪堆積，有效緩解乙醇對(duì)肝臟組織的損傷。聯(lián)苯雙脂作為目前治療臨床慢性病毒性、黃疸性肝炎的常見(jiàn)藥物，具有較好的治療效果，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生肝腎毒副作用13，14，實(shí)驗(yàn)表明蝦青素可能通過(guò)抗氧化途徑改善乙醇性肝損傷，雖作用效果不如聯(lián)苯雙脂，但沒(méi)有任何毒副作用。因此蝦青素有可能逐漸成為一種選擇性的輔助藥物運(yùn)用于此類(lèi)肝損傷的治療與預(yù)防。 【參考文獻(xiàn)】  1 韓 婷,井 源,吳 靜.酒精性脂肪肝的肝損傷機(jī)制研究近況J.實(shí)用肝臟病雜志,2007,6（4）:30-33.2 惠伯棣.類(lèi)胡蘿卜素化學(xué)與生