高效薄層色譜法鑒別6種中藥多糖

1、高效薄層色譜法鑒別6種中藥多糖楊成，管佳，章江生，李紹平*（澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，澳門）摘要：目的 鑒別不同來源的中藥多糖。方法 采用高效薄層色譜法分析多糖酸水解產(chǎn)物，同時應(yīng)用2種顯色劑以及薄層掃描技術(shù)，獲得可區(qū)別中藥多糖的特征圖譜。結(jié)果 以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5: 5:4.5:1.5:1.5(v/v)為展開劑， 7種標(biāo)準(zhǔn)單糖和2種糖醛酸為對照，使用苯胺-二苯胺為糖類成分顯色劑，結(jié)合茚三酮顯色劑檢查氨基酸類成分，獲得了多糖酸水解產(chǎn)物中兩類成分的特征薄層色譜，可用于區(qū)分來自冬蟲夏草、靈芝、黃芪、人參、西洋參和三七的6種多糖組分。結(jié)論 建立了一種可鑒別6種中藥多糖的高效薄層色譜

2、法，此法簡單快速，經(jīng)濟(jì)實用，可以用于多糖類成分質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：多糖，高效薄層色譜，質(zhì)量控制，中藥Discrimination of Polysaccharides from Six Traditional Chinese Medicines using High-performance Thin-layer ChromatographyYANG Cheng, GUAN Jia, ZHANG Jiang-sheng, LI Shao-ping* (Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao SAR, Chi

3、na)ABSTRACT: OBJECTIVE To distinguish the polysaccharides from different Traditional Chinese medicines (TCMs). METHODS The acid hydrolyzates of polysaccharides were analyzed by high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) combined with two coloration methods and thin layer scanning technique.

4、RESULTS The chromatography was performed on nano silica gel 60 plate with n-butanol -methanol-chloroform- acetic acid-water (12.5:5:4.5:1.5:1.5, v/v/v/v/v) as mobile phase. 7 monosaccharides and 2 glycuronic acids were used as reference compounds. The aniline-diphenylamine solution and ninhydrin sol

5、ution were employed for detection of saccharides and amino acids, respectively. The polysaccharides from Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Astragalus memberanaceus, Panax ginseng, Panax quinquefolii and Panax notogiseng were easily discriminated based on their characteristic TLC profiles. CONCL

6、USION A simple, rapid and effective HPTLC method was developed for distinguishing the polysaccharides from 6 TCMs, which is helpful to control the quality of polysaccharides from Chinese medicine.KEY WORDS: Polysaccharides; HPTLC; Quality control; TCMs多糖是一類由單糖（通常大于10個）通過糖苷鍵連接而成的生物大分子聚合物，是生物體維持生命活動的必

7、需物質(zhì)。近年來，由傳統(tǒng)中藥及天然藥物中分離得到的多糖類成分，因其廣泛的生物活性，如抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫，抗病毒等1-4已成為多糖研究的熱點。然而，如何鑒別不同來源的中藥多糖一直是個難題，也是多糖質(zhì)量控制的關(guān)鍵問題。目前多種現(xiàn)代儀器分析方法，如薄層色譜5、氣相色譜6、高效液相色譜7、質(zhì)譜8、核磁共振9等已應(yīng)用于多糖的結(jié)構(gòu)分析中，其中薄層色譜因其簡單、快速、樣本量大、成本低等優(yōu)點已成為單糖、寡糖成分鑒別的常用方法5。本文應(yīng)用高效薄層色譜（HPTLC）法對6種常用中藥多糖的酸水解產(chǎn)物進(jìn)行分析，以7種單糖和2種糖醛酸為對照，采用2種不同的顯色劑對組成糖類成分及結(jié)合氨基酸類成分分別顯色，獲得了可用于鑒別的特

8、征薄層色譜。1 儀器與試藥Desga 高效薄層系統(tǒng)（含AS30自動點樣器，CD60掃描儀，Pro Quant掃描軟件 德國Desga公司）；雙槽展開缸；高效硅膠60板（德國MACHEREY-NAGEL 公司）。微波提取儀 (Multiwave3000, Antonpaar, 奧地利)D-半乳糖，D-葡萄糖，D-核糖，D-木糖，D-甘露糖，L-阿拉伯糖，L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖醛酸(美國Sigma公司); 水（MilliQ 純水）；其他試劑均為分析純。人參（Panax ginseng），西洋參（Panax quinquefolii），三七（Panax notoginseng），冬蟲

9、夏草（Cordyceps sinesis）購于澳門中僑參茸公司，黃芪（Astragalus memberanaceus）采自山西，靈芝（Ganoderma lucidum）采自安徽金寨，均由通訊作者鑒定。2 方法2.1 對照品溶液的制備取D-葡萄糖0.5 mg，D-核糖1.5 mg，D-木糖1.5 mg，D-甘露糖0.5 mg，L-阿拉伯糖1.0 mg，L-鼠李糖0.5 mg，D-半乳糖醛酸1.0 mg，D-葡萄糖醛酸1.0 mg，精確稱定，溶于1 mL 95%乙醇制成混合對照品溶液。2.2 供試品溶液的制備取干燥藥材粉末1 g，加入10 mL水，置微波提取儀中于120 C 下提取15 min

10、，提取液于4500 rpm下離心10 min后取上清液，加入40 mL 95%乙醇后于4 C冰箱內(nèi)醇沉過夜?；鞈乙涸俅坞x心，棄去上清液，沉淀以5 mL 95%乙醇洗滌2次后冷凍干燥得粗多糖。取粗多糖10 mg溶于5 mL三氟醋酸（TFA），置于氮氣保護(hù)密封試管內(nèi)100 C水解2 h。水解液低壓旋干，殘渣溶于1 mL 50%乙醇得供試品溶液。2.3展開劑和顯色劑以正丁醇：甲醇：氯仿：冰醋酸：水=12.5:4.5:5:1.5:1.5(v/v) 展開，苯胺-二苯胺溶液（二苯胺4 g、苯胺4 mL、85%磷酸20mL混合溶解于200 mL丙酮溶液中）和茚三酮溶液（0.2 g茚三酮溶解于100 mL 丙

11、酮中）為顯色劑。2.4 薄層層析高效薄層板（20 cm×10 cm），點樣量10 L，混合對照品點樣1 L，樣品條帶寬10 mm，間隔15 mm，起始點樣高度10 mm。點樣后薄層板放入已預(yù)先飽和30 min的雙槽層析缸中展開，展開距離9 cm，取出吹干，噴顯色劑苯胺-二苯胺顯色后，130 C加熱顯色至斑點清晰；或噴茚三酮后，105C加熱顯色至斑點清晰，覆蓋同樣大小玻璃板，四周用膠布封固后作薄層掃描。3 結(jié)果3.1多糖水解條件的優(yōu)化3.1.1酸的選擇參考文獻(xiàn)10的方法，以人參多糖為樣品分別使用硫酸、鹽酸和三氟醋酸進(jìn)行完全酸水解考察。硫酸水解：10 mg樣品加入5mL 1 molL-1

12、硫酸，密封試管100 C下水解4 h，水解液冷卻后加入足量碳酸鋇中和，4500 rpm下離心10min后收集上清液，沉淀以5 mL 50%乙醇洗滌后再離心，合并上清液。上清液于40 C下低壓蒸干，殘渣溶于1 mL 50%乙醇備用。鹽酸水解：10mg樣品加入5 mL 2 molL-1鹽酸，100 C水解4 h，水解液冷卻后加入NaOH溶液中和，溶液于40 C下低壓蒸干，殘渣溶于1mL 50%乙醇備用。三氟醋酸水解：水解方法同2.2，水解時間為4 h。結(jié)果見圖1，由圖可見，鹽酸水解后因中和步驟產(chǎn)生大量的NaCl，干擾了展開條帶；硫酸水解產(chǎn)物可得清晰條帶，但因中和步驟繁瑣而導(dǎo)致產(chǎn)物損失；采用TFA水

13、解，操作簡單，條帶多且清晰，產(chǎn)物損失較小，故選用TFA進(jìn)行多糖水解。圖1 多糖水解用酸的選擇L1TFA水解；L2硫酸水解；L3鹽酸水解；L4混合對照品；1，D-半乳糖醛酸；2，D-葡萄糖醛酸；3，D-半乳糖；4，D-葡萄糖；5，D-甘露糖；6，D-阿拉伯糖；7，D-木糖；8，D-核糖；9，L-鼠李糖Fig1 Selection of the acid for hydrolysis of polysaccharidesL1TFA hydrolysate; L2H2SO4 hydrolysate; L3HCl hydrolysate; L4Mixed standards; 1, D-Galactu

14、ronic acid; 2, D-Glucuronic acid; 3, D-Galactose; 4, D-Glucose; 5, D-Mannose; 6 L-Arabinose; 7, D-Xylose; 8, D-Ribose; 9, L-Rhamnose3.1.2 酸濃度的優(yōu)化以3.1.1中TFA水解的條件，分別使用2、1.5、1 molL-1 TFA進(jìn)行水解，考察不同濃度TFA對多糖水解的影響。結(jié)果如圖2，由圖可見，隨酸濃度降低，水解不完全，釋放出的半乳糖醛酸（條帶1）減少，且條帶3下方條帶（可能是未水解寡糖）增多，干擾糖醛酸檢測，因此酸濃度選用2 molL-1。圖2三氟乙酸濃度的

15、優(yōu)化L12 molL-1；L21.5 molL-1；L31 molL-1；L4混合對照品；19，同圖1Fig 2 Optimization of TFA concentration for the hydrolysisL12 molL-1; L21.5 molL-1; L31molL-1; L4Mixed standards; 19，same as in Fig 13.1.3水解時間的優(yōu)化以3.1.2中確定的TFA水解條件，分別考察4 h、2 h、1 h等不同水解時間。結(jié)果如圖3，由圖可見，1 h時水解不完全，條帶3下方可見明顯未水解寡糖條帶，干擾糖醛酸檢測，2 h與4 h水解效果相近，因此選

16、擇水解2 h。圖3多糖酸水解時間的優(yōu)化L14 h；L22 h；L31 h；L4混合對照品；19，同圖1Fig 3 Optimization of TFA hydrolysis time L14 h ; L22 h; L31 h; L4Mixed standards; 19，same as in Fig 13.1.4 重復(fù)性考察以3.1.3中所確定的TFA水解條件，取3份人參多糖樣品平行水解，考察重復(fù)性，結(jié)果如圖4，表明本水解條件重復(fù)性良好。圖4水解重復(fù)性考察L1L3，3份平行水解樣品；L4混合對照品；19，同圖1Fig 4 Repeatability for acid hydroly

17、sis of polysaccharides from ginsengL1L3，3 hydrolyzates; L4Mixed standards; 19，same as in Fig 13.2 多糖的薄層色譜鑒別3.2.1組成糖類成分特征色譜6種中藥多糖經(jīng)完全酸水解后，以苯胺二苯胺試劑顯色，可得組成糖類成分特征色譜，如圖5。由圖可見，6種多糖的主要組成單糖均有葡萄糖，半乳糖，甘露糖，其中黃芪多糖、人參多糖、西洋參多糖及三七多糖中還含有少量阿拉伯糖與鼠李糖，并伴有少量半乳糖醛酸。靈芝多糖中呈現(xiàn)一條特殊的黃綠色條帶（圖中箭頭所示），可與其他多糖區(qū)分。冬蟲夏草多糖中沒有檢測到糖醛酸。綜上，通過糖類

18、成分特征圖譜，冬蟲夏草多糖及靈芝多糖可明顯區(qū)別與其他四種植物多糖。圖5 6種中藥多糖酸水解產(chǎn)物的苯胺二苯胺顯色薄層色譜圖L1，黃芪；L2，冬蟲夏草；L3，靈芝；L4，西洋參；L5，人參；L6 三七；L7混合對照品；19，同圖1Fig 5 HPTLC photographs of acid hydrolyzates of polysaccharides from six TCMs colorized by aniline-diphenylamine solution LI，Astragalus memberanaceus； L2，Cordyceps sinesis；L3， Ganoderma l

19、ucidum；L4，Panax quinquefolii；L5，Panax ginseng；L6，Panax notoginseng；L7Mixed standards; 19，same as in Fig 13.2.2氨基酸類成分特征色譜6種多糖經(jīng)完全酸水解后，以茚三酮試劑顯色，可得多糖中氨基酸類成分的特征色譜，如圖6。圖6 6種中藥多糖水解產(chǎn)物的茚三酮顯色薄層色譜圖L1L6，同圖5；AK，特征條帶Fig 6 HPTLC photographs of acid hydrolyzates of polysaccharides from six TCMs colorized by ninhydr

20、in solution LIL6，same as in Fig 5；AK，characteristic bands另對靈芝中5個特征條帶（A，B，K，D和J）做光譜掃描，發(fā)現(xiàn)該類顯色成分在550 nm處有最大吸收，故以550 nm為掃描波長，背景吸收較弱的700 nm為參比波長，對所有樣品進(jìn)行透射模式掃描，狹縫寬度為6.00 nm × 0.02 nm。結(jié)果如圖7。圖7 6種中藥多糖水解產(chǎn)物的茚三酮顯色光譜掃描圖（= 550 nm）L1L6，同圖5；AK，圖6中特征條帶對應(yīng)的色譜峰Fig 7 HPTLC scanning profiles of acid hydrolyzates of

21、 polysaccharides from six TCMs colorized by ninhydrin solutionLIL6，same as in Fig 5；AK，peaks of characteristic bands in Fig 6.由圖可見，黃芪、靈芝、冬蟲夏草多糖水解產(chǎn)物中含有較多可使茚三酮顯色的物質(zhì)，而人參、三七和西洋參多糖中則較少。冬蟲夏草多糖（L2）可見H、I 兩個特征的條帶；而靈芝多糖（L3）亦含有一特征條帶K；黃芪多糖（L1）則含有一特征條帶C，另外黃芪中含有條帶F而靈芝與蟲草中幾乎沒有，且蟲草和靈芝中有J帶而黃芪則沒有，由此可區(qū)分黃芪多糖。西洋參多糖（L4）有

22、明顯的D條帶，而三七與人參中不含有；三七與人參多糖（L5與L6）的結(jié)果較為相似，但L5中的A條帶的顏色明顯深于L6。綜上，通過氨基酸類成分特征圖譜，6種中藥多糖基本可以明確區(qū)分。4 討論4.1本研究通過優(yōu)化酸水解條件，以獲得多糖的完全酸水解產(chǎn)物，保證結(jié)果的重現(xiàn)及特征圖譜的穩(wěn)定。另本文應(yīng)用薄層色譜成功分離分析了七種單糖及兩種糖醛酸，可用于多糖的組成分析。4.2多糖經(jīng)完全酸水解后可釋放出組成單糖及其他結(jié)合物質(zhì)，應(yīng)用苯胺二苯胺試劑可對糖類成分顯色，檢測組成單糖的種類；而水解產(chǎn)生的氨基酸類成分，則可由茚三酮試劑顯色。所獲得的兩類成分特征圖譜，較全面反映了多糖組分的信息，增強(qiáng)了譜圖的特征性。4.3本文所

23、建立的高效薄層色譜法簡單快速，操作簡便，結(jié)果直觀，可有效鑒別不同來源的中藥多糖，為其質(zhì)量控制提供了一條新思路。REFERENCES1 FANG J N, DING K. Bioactivities, isolation and purification methods of polysaccharide J. Chin J Nat Med (中國天然藥物), 2007, 5 (5): 338-347.2 BAO X F, ZHEN Y, RUAN L,et al. Purication, characterization and modication of T l

24、ymphocyte-stimulating polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum.J. Chem Pharm Bull，2002，50 (5): 623-629.3 DONG Q, YAO J, FANG J N, et al Structural characterization and immunological activity of two cold-water extractable polysaccharides from Cistanche deserticola Y. C. Ma.J. Carbohydr Res, 20

25、07, 342 (10): 1343-1349.4 YAMAGUCHI Y, KAGOTA S, NAKAMURA K ,et al. Antioxidant activity of the extracts from fruiting bodies of cultured Cordyceps sinensis.J. Phytother. Res., 2002, 14 (8): 647649.5 DI X, CHAN K C, LEUNG H W et al. Fingerprint profiling of acid hydrolyzates of polysaccharides extracted from the fruiting bodies and spores of lingzhi by high-performance thin-layer chromatography J. J. Chromatogr. A 2003, 1018 (1)