金屬硫蛋白對奶?？箲つ芰Φ挠绊?

1、中國科技論文在線金屬硫蛋白對奶?？箲つ芰Φ挠绊懟痦椖浚簢易匀豢茖W基金項目（31072053；30671516）和湖南省博士生科技創(chuàng)新基金項目（CX2010B284） 楊夏1，李麗立2，張彬1作者簡介：楊夏（1988-），女，動物科學專業(yè)應屆畢業(yè)生通信聯(lián)系人：張彬（1955-），男，博士，教授，博導，主要研究方向：動物營養(yǎng)生理. E-mail: zhb8236College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128;Institute of Subtropical Agric

2、ultural Ecology,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125;College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128;中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125;湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128410128;410125;41012815874275682139758907290731-84618088;0731-8

3、4618088長沙市湖南農業(yè)大學動物科學技術學院;長沙市芙蓉區(qū)中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所;長沙市湖南農業(yè)大學動物科學技術學院274188254QQ.com;isi;zhb8236楊夏（1988-），女，動物科學專業(yè)應屆畢業(yè)生;李麗立（1956），女，研究員，主要研究方向：動物營養(yǎng)學;張彬（1955-），男，博士，教授，博導，主要研究方向：動物營養(yǎng)生理楊夏;李麗立;張彬YANG Xia;LI Lili;ZHANG Bin張彬國家自然科學基金項目（31072053；30671516）和湖南省博士生科技創(chuàng)新基金項目（CX2010B284）1.5|1|楊夏|YA

4、NG Xia|湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128|College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128|楊夏（1988-），女，動物科學專業(yè)應屆畢業(yè)生|長沙市湖南農業(yè)大學動物科學技術學院|410128|274188254QQ.com15874275682<CR>|2|李麗立|LI Lili|中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125|Institute of Subtropical Agricultural Ec

5、ology,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125|李麗立（1956），女，研究員，主要研究方向：動物營養(yǎng)學|長沙市芙蓉區(qū)中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所|410125|isilt;CR>*|3|張彬|ZHANG Bin|湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128|College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128|張彬（1955-），男，博士，教授，博導，主要研究方向：動物營養(yǎng)生理

6、|長沙市湖南農業(yè)大學動物科學技術學院|410128|zhb823613975890729金屬硫蛋白對奶?？箲つ芰Φ挠绊憒Effects of metallothionein on anti-stress ability in dairy cattle|國家自然科學基金項目（31072053；30671516）和湖南省博士生科技創(chuàng)新基金項目（CX2010B284）- 6 -（1. 湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128；2. 中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125）摘要：為探討外源性金屬硫蛋白(MT)對奶牛抗應激能力的影響，選取24頭中國荷斯

7、坦奶牛經(jīng)產泌乳母牛，隨機等分為A、B、C、D 4組，分別每頭靜脈注射經(jīng)生理鹽水溶解的Zn-MT 0（對照），5.0，10.0和15.0 mg，測定了各組奶牛的GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。結果表明：B組、C組和D組奶牛的GSH-Px、SOD、CAT和T-AOC均顯著（P0.05或P0.01）高于對照組；而MDA含量均顯著（P0.05）低于對照組。說明MT不失為一種能夠有效調控奶?？箲つ芰Φ纳砘钚晕镔|。關鍵詞：金屬硫蛋白；抗應激；GSH-Px；CAT；T-AOC；MDA；奶牛中圖分類號：S813.4Effects of meta

8、llothionein on anti-stress ability in dairy cattleYANG Xia1, LI Lili2, ZHANG Bin1(1. College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128;2. Institute of Subtropical Agricultural Ecology,The Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125)Abstract: In order to approach

9、the effects of exogenous metallothionein(MT) on anti-stress ability in dairy cattle, 24 lactating cows from Chinese Holstein wrer used in this experiment. They were randomly allocated to Group A,groupB, Group C and Group D,and MT was supplemented at 0 mg.capita-1,5.0 mg.capita-1,10.0 mg.capita-1 and

10、 15.0mg.capita-1 respectively by intravenous injection.The results showed that the activities of blood GSH-Px, Erythrocyte SOD and serum CAT and the serum levels of the cows in group B,Group C and Group D were higher（P0.05 or P0.01）than those in Group A,while the serum MDA content were lower（P0.05）t

11、han those in Group A. The experimental results suggested that exogenous MT should be an effective anti-stress substance and physiologic accommodation composition for dairy cattle.Key words: metallothionein；anti-stress；GSH-Px；CAT；T-AOC；MDA；dairy cattle0 引言金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是動物體內廣泛存在的重要的生理活性物質，

12、在清除體內自由基、增強機體的免疫力，提高機體抗氧化應激能力等方面具有廣泛而重要的生理學和生物學功能1-3，因而在促進動物健康養(yǎng)殖、提高畜產品質量、保證人類健康和食品安全等方面均具有重大意義和廣闊應用前景。但國內外對MT的研究對象至今仍主要局限于實驗動物和人類，而以畜禽尤其是奶牛為研究對象的報道不多4。鑒于由奶牛生物學特性決定的應激敏感性以及奶和奶制品抗氧化的重要性，本論文擬以中國荷斯坦奶牛為實驗對象，研究外源性MT對夏季熱應激條件下奶牛的常規(guī)生理指標及與應激相關的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、紅細胞超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶(CAT)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙

13、二醛(MDA)含量的影響，為MT的理論研究及其在生產優(yōu)質安全奶產品中的應用提供科學依據(jù)。1材料與方法1.1材料及其來源MT系用鋅誘導法5制備、分離和純化的奶牛肝臟Zn-MT，并用間接競爭型ELISA法6定量。GSH-Px試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、T-AOC試劑盒和MDA試劑盒均系南京建成生物工程研究所產品。1.2試驗動物的選擇、分組與試驗設計 2009年7月-8月從長沙市某奶牛場選取年齡、體重、胎次、產犢時間、日泌乳量及以往泌乳期的產奶成績相近的中國荷斯坦奶牛健康經(jīng)產泌乳牛24頭，隨機分為A、B、C、D 4組，每組6頭。其中A組為對照組，B、C、D組為試驗組，分別在正式試驗開始的當天

14、（1d）每頭靜脈注射經(jīng)生理鹽水溶解的Zn-MT 5.0 mg、10.0 mg和15.0mg。預試期7d，正試期45d(1d-45d)。1.3飼養(yǎng)條件與管理方式各組奶牛飼喂相同日糧，日糧組成（kg/capita.d）：混合精料5.6、象草20.0、稻草10.0；合計35.6。每頭日攝入產奶凈能92.26MJ、粗蛋白1646.64 g、鈣69.76 g、磷43.44g。供試奶牛飼養(yǎng)在同一幢雙列式牛舍。專人飼養(yǎng)管理。各組奶牛的飼養(yǎng)管理方式一致。1.4測定項目與方法在正試期的第1d（注射MT前）、第15d、第30d和第45d分別從供試奶牛靜脈采血。GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC和MDA的測定

15、采用南京建成生物工程研究所提供的相應各類試劑盒并按試劑盒說明書操作。1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。采用SAS6.12統(tǒng)計軟件進行方差分析(GLM過程)，用Duncan統(tǒng)計方法進行多重比較以檢驗組間差異顯著性。2結果與分析2.1 MT對奶牛血液GSH-PX活性的影響補給外源性MT對奶牛血液GSH-PX活性變化的影響見表1。在正試期開始時（第1d），奶牛血液GSH-PX活性在各組間并沒有顯著差異（P0.05）。正試期第15d測得3個試驗組（B組、C組和D組）奶牛血液的GSH-PX活性分別顯著（P0.05）或極顯著（P0.01）地高于對照組（A組），而D組又顯著（P

16、0.05）地高于B組。正試期第31d測得3個試驗組的GSH-PX活性也分別顯著（P0.05）或極顯著（P0.01）地高于對照組，并且C組和D組均顯著（P0.05）地高于B組。在正試期第45d測得的結果是: C組和D組奶牛血液的GSH-PX活性均顯著（P0.05）地高于A組和B組。從正試期不同日齡所測奶牛血液的GSH-PX活性看，A組不同日齡間GSH-PX活性沒有大的變化（P0.05），3個試驗組在補給外源性MT后，奶牛血液的GSH-PX活性均有顯著提高，至31d達最高值，45d有所下降。其中B組第15d和第30d的GSH-PX活性顯著（P0.05）高于第1d和第45d。C組和D組第15d、第3

17、0d和第45d的GSH-PX活性均極顯著（P0.05或P0.01）地高于第1d。就15-45d平均值比較而言，B組和C組均顯著（P0.05）高于A組；而D組則極顯著（P0.01）地高于A組并顯著（P0.05）高于B組。表1 各組奶牛血液GSH-PX活性 Table 1 Blood GSH-Px activityt of the cows in different groups (U.L-1)A組 Group A B組 GroupBC組 Group C D組 Group D1d 257.32±24.38aA 256.27±25.73aA 255.89±26.24aA

18、 261.12±26.44aA 15d 263.24±27.10aA 297.73±30.05bB 313.04±29.78bcC 353.92±34.07cC30d 261.56±23.88aA 298.96±34.97bB 341.00±27.87cC 358.19±36.84cC45d 256.06±25.26aA 286.73±28.16aB 319.44±31.04bC 323.08±28.73bC15-45d平均值 260.29±25.88aA

19、 294.47±29.24bB 324.49±27.16bcC 345.06±30.84cC The mean during 15-45d注：同行肩標用小寫字母表示，同列肩標用大寫字母表示。同行（或同列）肩標相同字母示差異不顯著（p0.05），相鄰字母示差異顯著（P0.05），不相鄰字母示差異極顯著（P0.01）。下同。There are significant differences between figures in the same row with different lower-case letters such as a,b and b,c(P<

20、;0.05) or a,c(P<0.01),.and there are significant differences between figures in the same column with different capital-case letters such as A,B and B,C(P<0.05) orA,C(P<0.01).The same below.2.2 MT對奶牛紅細胞SOD活性的影響從表2可以看出：在正試期第15d測得C組和D組奶牛紅細胞SOD活性均顯著（P0.05）高于A組，而B組的SOD活性又比A組高出11.31（P0.05）。在正試期第3

21、0d和第45d，B組、C組和D組奶牛紅細胞SOD活性均顯著（P0.05）高于A組。補給外源性MT后，B組、C組和D組奶牛紅細胞SOD活性均有明顯提高，其中B組第30d和第45d的SOD活性顯著（P0.05）高于第1d；C組和D組第15d、第30d和第45d的SOD活性均顯著（P0.05）或極顯著（P0.01）地高于第1d。從15-45d平均值看，B組、C組和D組奶牛紅細胞SOD活性也均顯著（P0.05）地高于B組。表2 各組奶牛紅細胞SOD活性 Table 2 Erythrocyte SOD activityt of the cows in different groups（U.mL-1)A組

22、 Group A B組 GroupBC組 Group C D組 Group D1d 2249.24±218.14aA 2302.28±226.66aA 2230.26±222.76aA 2259.24±223.97aA15d 2270.27±223.48aA 2526.94±219.63abAB 2649.79±258.47bBC 2656.47±274.11bBC30d 2261.30±219.73aA 2602.26±245.47bB 2746.44±264.73bC 2701.3

23、1±267.46bC45d 2273.63±234.74aA 2601.61±252.46bB 2734.92±293.24bC 2693.47±267.32bBC15-45d平均值 2268.40±217.79aA 2576.94±240.27bB 2710.38±277.01bC 2683.75±268.14bBC The mean during 15-45d2.3 MT對奶牛血清CAT活性的影響如表3所示：試驗開始后，3個試驗組奶牛血清CAT活性也均較對照組有較大幅度的提高。在正試期第15d和第30

24、d，B組、C組和D組奶牛血清的CAT活性分別顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)地高于對照組。D組在正試期第45d的CAT活性也顯著(P<0.05)高于對照組；而B組和C組的CAT活性也高于對照組并低于D組，但均無顯著差異(P>0.05)。就正式試驗開始后3次測定的結果平均值而言，D組CAT活性分別顯著高于對照組(P<0.01)和B組(P<0.05)，而C組也顯著高于對照組(P<0.05)。就組內不同階段相比較，B組僅第15d時的CAT活性較正式試驗開始時有明顯提高(P<0.05)；而C組和D組第15d、30d和45d的CAT活性均比正式

25、試驗開始時有明顯提高(P<0.05或P<0.01)。 表3 各組奶牛血液CAT活性 Table 3 Serum CAT of the cows in different groups (U.L-1)采樣時間Time of samplingA組Group AB組Group BC組Group CD組Group D1d 2.63±0.27 aA 2.57±0.30 aA 2.66±0.26 aA 2.69±0.32 aA15d 2.55±0.30 aA 2.89±0.27bcB 3.29±0.33bcBC 3.54&#

26、177;0.36cC30d 2.56±0.29 aA 2.71±0.28aA 3.08±0.32cC 3.30±0.29cBC45d 2.52±0.26 aA 2.65±0.24abAB 2.81±0.27abBC 2.97±0.30 bBC15-45d平均值 2.54±0.26a 2.75±0.27ab 3.06±0.29bc 3.27±0.31cThe mean during 15-45d 2.4 MT對奶牛血清T-AOC的影響從表4可以看出，補給外源性MT后的第15d和

27、第30d，C組和D組奶牛血清T-AOC分別極顯著(P<0.01)高于對照組，而B組也顯著(P<0.05)高于對照組。D組在第45d時的T-AOC極顯著(P<0.01)高于對照組和B組，并且顯著(P<0.05)高于C組；B組和C組又分別顯著(P<0.05)高于對照組。3個試驗組在后3個階段測得的T-AOC均較正式試驗開始時有顯著(P<0.05，B組)或極顯著(P<0.01，C組和D組)提高，僅對照組的T-AOC在各階段的變化不明顯(P>0.05)。D組在正式試驗開始后3次測定的奶牛血清T-AOC平均值分別顯著(P<0.05)地高于B組并且極顯

28、著(P<0.01)地高于對照組；B組和C組也顯著(P<0.05)地高于對照組。表4 各組奶牛血清T-AOC Table 4 Serum T-AOC of the cows in different groups (U.L-1)采樣時間Time of samplingA組Group AB組Group BC組Group CD組Group D1d 7.11±0.70 aA 7.28±0.72 aA 7.27±0.71 aA 7.36±0.69 aA15d 7.10±0.68 aA 8.28±0.84bcB 8.89±0

29、.88cC 9.17±0.97cC30d 7.17±0.71aA 7.86±0.77bcB 8.74±0.83cC 9.07±0.86cBC 45d 7.15±0.74aA 7.80±0.78bB 8.55±0.84bcB 8.84±0.86dBC15-45d平均值 7.14±0.70a 7.98±0.76b 8.73±0.83bc 9.03±0.87cThe mean during 15-45d2.5 MT對奶牛血清MDA含量的影響由表5可知，與前已述及的MT對奶

30、牛GSH-PX、SOD、CAT等抗氧化酶活性和T-AOC的影響形成鮮明對照的是：補給外源性MT后，3個試驗組奶牛血清MDA含量均較對照組有不同程度的降低。其中B組第45d、C組第30d和第45d、D組第15d、第30d和第45d的MDA含量顯著（P0.05）低于A組。3個試驗組在正式試驗開始后3次測定的奶牛血清MDA含量平均值均顯著(P<0.05)高于對照組，而在3個試驗組之間沒有明顯差異（P0.05）。各組內不同時間所測MDA含量的變化趨勢大體是：隨著MT處理后時間的延長，奶牛血清MDA含量遞減。其中B組第45d、C組第30d和第45d、D組第15d、第30d和第45d的MDA含量顯著

31、（P0.05）低于用MT處理之前的MDA含量。表5 各組奶牛血清MDA含量 Table 5 Serum MDA content of the cows in different groups (mmoL.L-1)A組 Group A B組 GroupB C組 Group C D組 Group D1d 4.37±0.42aA 4.32±0.44aA 4.49±0.46aA 4.38±0.39aA15d 4.35±0.42aA 4.09±0.42aA 4.00±0.41aAB 3.89±0.35bB30d 4.39&#

32、177;0.41aA 3.95±0.40abAB 3.81±0.36bB 3.72±0.36bB45d 4.41±0.44aA 3.77±0.41bB 3.70±0.39bB 3.62±0.37bB15-45d平均值 4.38±0.39a 3.93±0.41b 3.84±0.37b 3.74±0.38bThe mean during 15-45d3 討論集約化生產以及對畜禽主要經(jīng)濟性狀施加強大選擇壓是現(xiàn)代畜牧業(yè)的基本特征之一。集約化生產環(huán)境和高強度的生產狀態(tài)，時時刻刻對畜禽產生著重大的

33、影響，尤其是處于高強度生產狀態(tài)和具有高敏感性體質的奶牛，應激更為頻繁和劇烈。一般認為：應激的始作俑者是自由基(freera dical)，許多生物分子都可成為其攻擊對象，受其攻擊而產生的脂質過氧化的產物(如MDA)不但攻擊生物膜上的蛋白質和脂類，而且還攻擊細胞內其它的巰基酶和巰基蛋白，甚至DNA、RNA，從而引起過氧化損傷，造成細胞結構和功能的損害，使機體產生氧化應激，免疫力和生產力下降、出現(xiàn)病變、甚至死亡7。體內有自由基產生，也存在自由基清除系統(tǒng)。正常情況下，機體存在一個完整的包含酶系和非酶系的抗氧化系統(tǒng)，抗氧化酶包括GSH-PX、SOD、CAT等，非酶系抗氧化劑有VE、一胡羅卜素、還原性谷

34、胱甘肽等，它們協(xié)同作用，使體內過多的自由基轉變?yōu)闊o害的水，使自由基的產生與清除處于動態(tài)平衡之中，防止生物分子產生損傷。起到抗氧化的作用8。因此，MDA含量常常反映了機體脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。而GSH-PX、SOD、CAT等抗應激酶活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。 MT這種富含半胱氨酸巰基的功能性結合蛋白，是一種強的自由基清除劑，能有效防止脂質過氧化和DNA損傷，起到應激保護作用9。前人研究表明，用酵母類金屬硫蛋白飼喂小鼠，適宜劑量的MT可降低肝中過氧化脂質(LPO)含量，能提高體內SOD等氧化酶的活性10。另有報道，以不同劑量的Zn-MT灌喂昆明小鼠，MT具有提高小鼠肝中SOD、GSH-PX活力（P<0.05，P<0.01）和降低肝中MDA含量（P<0.05）以及增強免疫的作用11。本研究結果表明，注射外源Zn-MT后，在一定的時間和濃度下，可顯著提高奶牛血液GSH-PX、C